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基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法 0 0

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申请进展

基本信息

申请人信息

代理人信息

摘要

法律状态

权利要求

说明书

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2019-04-19

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2019-09-13

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

2022-05-24

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2039-04-19

基本信息

有效性	有效专利	专利类型	发明专利
申请号	CN201910316875.5	申请日	2019-04-19
公开/公告号	CN110146428B	公开/公告日	2022-05-24
授权日	2022-05-24	预估到期日	2039-04-19
申请年	2019年	公开/公告年	2022年
缴费截止日
分类号	G01N15/10	主分类号	G01N15/10
是否联合申请	独立申请	文献类型号	B
独权数量	1	从权数量	6
权利要求数量	7	非专利引证数量	1
引用专利数量	0	被引证专利数量	0
非专利引证	1、CN 101300472 A,2008.11.05CN 107238556 A,2017.10.10CN 109212027 A,2019.01.15CN 108254437 A,2018.07.06CN 101010582 A,2007.08.01CN 105021668 A,2015.11.04KR 20150042317 A,2015.04.21Hsu-Chao Hao.et al.Sensitive, Rapidand Specific Technique for the Detectionof Antigen-specific Cells on ShearHorizontal Surface Acoustic Wave (SH-SAW)Sensors《.IEEE SENSORS 2010 Conference》.2011,第10卷(第2期),;
引用专利		被引证专利
专利权维持	3	专利申请国编码	CN
专利事件		事务标签	公开、实质审查、授权

申请人信息

申请人	杭州电子科技大学	第一申请人	杭州电子科技大学
专利权人	杭州电子科技大学	当前专利权人	杭州电子科技大学
发明人	轩伟鹏、胡天玉、张文瑞、陈金凯、黄汐威、孙玲玲、骆季奎	第一发明人	轩伟鹏
地址	浙江省杭州市下沙高教园区2号大街	邮编	310018
申请人数量	1	发明人数量	7
申请人所在省	浙江省	申请人所在市	浙江省杭州市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

杭州君度专利代理事务所

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

黄前泽

摘要

本发明公开了基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法。现有细胞计数方法要么只适合体积大的细胞计数或价格昂贵，要么时间过长。本发明在声表面波器件的声表面波传播路径上制作微流通道；通过微量泵连接注射器输送细胞流体或粒子流体进入微流通道，利用鞘流技术驱动细胞流体或粒子流体实现聚焦，使微流通道中的细胞或粒子呈现单排列，细胞或粒子间保持距离，依次流过微流通道；声表面波器件与检测仪器连接，检测仪器工作后，测出传输参数，通过绘制传输参数在谐振频率点的值随着时间变化的图像，得到细胞或粒子数量信息。本发明通过测试传输参数的方式变现出来，达到了实时测试数据，提高了技术精度。

摘要附图
说明书附图：图1(a)
说明书附图：图1(b)
说明书附图：图2(a)
说明书附图：图2(b)
说明书附图：图3
说明书附图：图4
说明书附图：图5
说明书附图：图6
说明书附图：图7
说明书附图：图8(a)
说明书附图：图8(b)

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2022-05-24	授权
2	2019-09-13	实质审查的生效	IPC(主分类): G01N 15/10 专利申请号: 201910316875.5 申请日: 2019.04.19
3	2019-08-20	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1.基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法，其特征在于：该方法具体如下：
1)在压电衬底上制作具有叉指电极的声表面波器件；所述的压电衬底采用压电单晶材料或压电薄膜材料；压电单晶材料为铌酸锂、钽酸锂或石英，压电薄膜材料为氧化锌薄膜或氮化铝；叉指电极材料为金、铝、Mo、W、Pt、石墨烯、碳纳米管、碳纳米管复合材料或导电胶；
所述的叉指电极是平行叉指电极或聚焦型叉指电极；若叉指电极为平行型，叉指宽度为
100nm～100um，叉指间距为100nm～100um，声孔径为100um～10mm，叉指对数为10～100对；
若叉指电极为聚焦型，弧度为120°，声表面波的波长为1～100um,叉指对数为10～50对；
2)在声表面波器件的声表面波传播路径上制作微流通道；
3)通过微量泵连接注射器输送细胞流体或粒子流体进入微流通道，利用鞘流技术驱动细胞流体或粒子流体实现聚焦，使微流通道中的细胞或粒子呈现单排列，细胞或粒子间保持距离，依次流过微流通道；
4)声表面波器件与检测仪器连接，检测仪器工作后，测出传输参数，通过绘制传输参数在谐振频率点的值随着时间变化的图像，得到细胞或粒子数量信息。

2.根据权利要求1中任一项所述的基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法，其特征在于：所述的鞘流技术通过微流通道的结构实现，微流通道选用玻璃材料，微流通道包括玻璃管道A、玻璃管道B和玻璃管道C；玻璃管道A的入流口a通入细胞培养液，玻璃管道B的入流口b通入细胞与培养液的混合物，玻璃管道C的入流口c通入细胞培养液；玻璃管道A和玻璃管道C的出流口均连通玻璃管道B中部的汇流口e，玻璃管道B的出流口为d，玻璃管道A中细胞培养液、玻璃管道B中的细胞与培养液混合物以及玻璃管道C的细胞培养液在玻璃管道B的汇流口汇流后由玻璃管道B的出流口输出；由于玻璃管道A和玻璃管道C的鞘流聚焦作用，使得汇流口e到玻璃管道B的出流口d的这段管道中的细胞呈现单排列，细胞间保持距离。

3.根据权利要求1中任一项所述的基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法，其特征在于：所述的鞘流技术通过微流通道的结构实现，微流通道选用玻璃材料，微流通道包括玻璃管道A、玻璃管道B和玻璃管道C；玻璃管道A的入流口a通入磷酸盐缓冲液，玻璃管道B的入流口b通入粒子与磷酸盐缓冲液的混合物，玻璃管道C的入流口c通入磷酸盐缓冲液；玻璃管道A和玻璃管道C的出流口均连通玻璃管道B中部的汇流口e，玻璃管道B的出流口为d，玻璃管道A中磷酸盐缓冲液、玻璃管道B中的细胞与磷酸盐缓冲液混合物以及玻璃管道C的磷酸盐缓冲液在玻璃管道B的汇流口汇流后由玻璃管道B的出流口输出；由于玻璃管道A和玻璃管道C的鞘流聚焦作用，使得汇流口e到玻璃管道B的出流口d的这段管道中的粒子呈现单排列，粒子间保持距离。

4.根据权利要求1所述的基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法，其特征在于：所述检测仪器是单独的声表面波检测仪或实验用的网络分析仪；声表面波器件的一个叉指电极接收检测仪器的射频信号，发出声表面波，通过压电衬底和微流通道，被声表面波器件的另一个叉指电极接收，从而检测仪器测得传输参数的频率、幅度和相位随微流管道中液体有无细胞或粒子情况而变化，并通过检测传输参数的频率、幅度和相位，获得声波路径上有无细胞或粒子的信息，具体为：当微流通道中无细胞时，液体吸收声波，接收端叉指电极所获得的信号较弱，测得传输参数在谐振频率点的值较小；当管道液体中含有细胞时，由于细胞有细胞膜，细胞膜的存在会阻止声波的吸收，声波被吸收的能量变小，接收端叉指电极所获得的信号比液体中不含有细胞时的信号强，测得传输参数在谐振频率点的值较大；而同等体积的磷酸盐缓冲液和同等体积的粒子与磷酸盐缓冲液混合物吸收声波的能量不同，接收端叉指电极所获得的信号也不同，测得传输参数在谐振频率点的值便不同；因此，通过绘制传输参数在谐振频率点的值随着时间变化的图像，并统计图像中尖点的个数实现细胞或粒子计数。

5.根据权利要求1或4中任一项所述的基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法，其特征在于：所述的压电衬底焊接在PCB基板上。

6.根据权利要求1或4中任一项所述的基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法，其特征在于：所述的注射器选用容积为1ml、内径为4.7mm的标准医用注射器。

7.根据权利要求2所述的基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法，其特征在于：所述的玻璃管道A和玻璃管道C中液体流速为3ul/min～1000ul/min，玻璃管道B中液体流速为
2ul/min～1000ul/min。

说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞计数技术，具体涉及基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法。

背景技术

[0002] 细胞是构成生物体结构和功能的最基本单位，执行生命有机体的各种功能。人体内每天都有许多细胞(RBC)衰老死亡和许多细胞新生，以维持生命体新陈代谢的动态平衡。但是这个动态平衡被破坏，就会造成一系列健康问题。通过检测特定细胞的数量，可以鉴别和诊断某些疾病，因此细胞计数对医疗保健，疾病治疗，医学研究具有很重要的意义，也是一个非常有用的工具。例如感染HIV的人体内的CD+4淋巴细胞会慢慢减少，通过检测CD+4淋巴细胞的数量可以辅助诊断病情；白血病人体内的红细胞会随着病情的进展从正常值逐渐降低，通过检测红细胞的数量获知病情的变化。各种癌症是目前我国死亡率最高的病因。癌症在发展发育期间，部分癌细胞会进入血液系统循环。通过俘获，细胞计数获得血液中特定的癌细胞的浓度(即单位体积中的癌细胞)，则可以有有效地诊断癌症，血液循环系统癌细胞的检测是近期发展起来的一门新兴科学技术，越来越受瞩目。

[0003] 现有的细胞计数技术大致分为以下几种：

[0004] 血球计数板计数法：将待测样品的悬浮液放在一块比普通载玻片厚的特制玻片上，载玻片上有4条槽构成三个平台，中间的平台被一横槽隔成两半，每边平台都刻上方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格就是细胞计数室。然后置于显微镜下直接计数。使用该方法能数出每个小方格中的细胞的个体数目，根据该小格所占的体积，快速地推算出单位体积的溶液中含有的细胞总数。但若悬液中不加可以区分细胞死活的试剂时，计数通常计得的是活菌体和死菌体的总和(有时还有微小杂物)，还有微小杂物也被计算在内，这样得出结果往往偏高，因此此法适用于体积较大的单细胞微生物的计数。该技术适合大量的细胞计数以及精度要求不高的情况下，如CD+4和红血球。

[0005] 流式细胞仪法：用于细胞数量定量化分析的仪器。具体操作是让细胞在流动的状态下流过流式细胞仪的检测区域，用激光激发出特异性荧光标记的抗体，被激发的荧光抗体发射出一定波长的荧光，细胞仪探测到激发光将光信号转化为电信号，同时检测细胞的物理和生化特征参数，根据这些参数和激发光特性区分不同种细胞，并且统计计数。这个方法虽然检测速度快，检测精度髙，但是配套仪器价格高昂，操作复杂，检测的成本高，操作环境要求高，在发展中的国家，或者偏远地区难以普及，且它的功能并不只针对细胞计数一种情况。这对于只有特定要求的检测实验会有某种程度上的浪费。

[0006] 图像细胞仪技术：结合显微镜和流式细胞术的新型细胞检测技术，将光学精密仪器测量细胞形态学参数技术结合图像处理技术，不仅可以测量大量细胞，还可以研究特定细胞的形态，得到细胞随时间变化的信息和组织内部细胞形态学特征，但是这种成像方法所用时间比较长，不能实时得到想要的结果。

[0007] 鉴于以上所述公开的细胞计数方法，存在几点缺陷，红细胞计数虽然能快速得到结果，但是结果可能会偏高，而且只适合体积大的细胞计数；流式细胞仪检测速度快，精度高，但是价格昂贵，偏远地区难以普及；图像细胞仪成像时间过长，不能实时得到结果。因此，需要考虑一种简单，可实时得到结果，精度高的方式去实现细胞计数。

发明内容

[0008] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种稳定性好、小型化、价格合适的细胞计数系统，将流动的样本流置于声表面波器件SAW的传播路径上，利用流动的样本流中细胞与细胞培养液吸收能量的不同，传输参数(S21)的频率，幅度，相位随微流管道中的液体情况而变化，测试传输参数实现计数。

[0009] 本发明采用以下技术方案：

[0010] 本发明基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法，具体如下：

[0011] 1)在压电衬底上制作具有叉指电极的声表面波器件。

[0012] 2)在声表面波器件的声表面波传播路径上制作微流通道。

[0013] 3)通过微量泵连接注射器输送细胞流体(细胞流体指培养液和细胞的混合物)或粒子流体(粒子流体指磷酸盐缓冲液和粒子的混合物)进入微流通道，利用鞘流技术驱动细胞流体或粒子流体实现聚焦，使微流通道中的细胞或粒子呈现单排列，细胞或粒子间保持距离，依次流过微流通道。

[0014] 4)声表面波器件与检测仪器连接，检测仪器工作后，测出传输参数，通过绘制传输参数在谐振频率点的值随着时间变化的图像，得到细胞或粒子数量信息。

[0015] 优选地，所述的压电衬底采用压电单晶材料或压电薄膜材料，压电单晶材料具体为铌酸锂(LiNbO3)、钽酸锂(LiTaO3)或石英，压电薄膜材料具体为氧化锌(ZnO)薄膜或氮化铝(ALN)；叉指电极材料为金、铝、Mo、W、Pt、石墨烯、碳纳米管、碳纳米管复合材料或导电胶。

[0016] 优选地，所述的叉指电极是平行叉指电极或聚焦型叉指电极。若叉指电极为平行型，叉指宽度为100nm～100um，叉指间距为100nm～100um，声孔径为100um～10mm，叉指对数为10～100对；若叉指电极为聚焦型，弧度为120°，声表面波的波长为1～100um,叉指对数为10～50对。具有聚焦型叉指电极的声表面波器件的优点是将声波聚焦于一点，更适合于微小细胞或粒子的精确计数。

[0017] 优选地，所述的鞘流技术通过微流通道的结构实现，微流通道选用玻璃材料，微流通道包括玻璃管道A、玻璃管道B和玻璃管道C；玻璃管道A的入流口a通入细胞培养液，玻璃管道B的入流口b通入细胞与培养液的混合物，玻璃管道C的入流口c通入细胞培养液；玻璃管道A和玻璃管道C的出流口均连通玻璃管道B中部的汇流口e，玻璃管道B的出流口为d，玻璃管道A中细胞培养液、玻璃管道B中的细胞与培养液混合物以及玻璃管道C的细胞培养液在玻璃管道B的汇流口汇流后由玻璃管道B的出流口输出。由于玻璃管道A和玻璃管道C的鞘流聚焦作用，使得汇流口e到玻璃管道B的出流口d的这段管道中的细胞呈现单排列，细胞间保持距离。

[0018] 优选地，所述的鞘流技术通过微流通道的结构实现，微流通道选用玻璃材料，微流通道包括玻璃管道A、玻璃管道B和玻璃管道C；玻璃管道A的入流口a通入磷酸盐缓冲液，玻璃管道B的入流口b通入粒子与磷酸盐缓冲液的混合物，玻璃管道C的入流口c通入磷酸盐缓冲液；玻璃管道A和玻璃管道C的出流口均连通玻璃管道B中部的汇流口e，玻璃管道B的出流口为d，玻璃管道A中磷酸盐缓冲液、玻璃管道B中的细胞与磷酸盐缓冲液混合物以及玻璃管道C的磷酸盐缓冲液在玻璃管道B的汇流口汇流后由玻璃管道B的出流口输出。由于玻璃管道A和玻璃管道C的鞘流聚焦作用，使得汇流口e到玻璃管道B的出流口d的这段管道中的粒子呈现单排列，粒子间保持距离。

[0019] 优选地，所述测试传输参数的检测仪器是单独的声表面波检测仪或实验用的网络分析仪。声表面波器件的一个叉指电极接收检测仪器的射频信号，发出声表面波(SAW)，通过压电衬底和微流通道，被声表面波器件的另一个叉指电极接收，从而检测仪器测得传输参数的频率、幅度和相位随微流管道中液体有无细胞或粒子情况而变化，并通过检测传输参数的频率、幅度和相位，获得声波路径上有无细胞或粒子的信息，具体为：当微流通道中无细胞时，液体吸收声波，接收端叉指电极所获得的信号较弱，测得传输参数在谐振频率点的值较小；当管道液体中含有细胞时，由于细胞有细胞膜，细胞膜的存在会阻止声波的吸收，声波被吸收的能量变小，接收端叉指电极所获得的信号比液体中不含有细胞时的信号强，测得传输参数在谐振频率点的值较大；而同等体积的磷酸盐缓冲液和同等体积的粒子与磷酸盐缓冲液混合物吸收声波的能量不同，接收端叉指电极所获得的信号也不同，测得传输参数在谐振频率点的值便不同；因此，通过绘制传输参数在谐振频率点的值随着时间变化的图像，并统计图像中尖点的个数实现细胞或粒子计数。

[0020] 优选地，所述的压电衬底焊接在PCB基板上。

[0021] 优选地，注射器选用容积为1ml、内径为4.7mm的标准医用注射器。

[0022] 优选地，玻璃管道A和玻璃管道C中液体流速为3ul/min～1000ul/min，玻璃管道B中液体流速为2ul/min～1000ul/min。

[0023] 本发明具有的有益效果：

[0024] (1)本发明提出了一种新型的细胞计数方法，与现有的细胞计数技术相比，具有实现简单，稳定性好，小型化，可靠性强等优势。

[0025] (2)本发明相比于传统的计数法，不需要考虑细胞体积的大小，合理的设计器件参数可达到精确计数。聚焦型声表面波器件，可以减少声波反射后处于激励频率的声表面波的干涉作用，其能量聚集在目标位置，更适合于微小细胞的精确计数。平行型声表面波器件，通过设计的孔径参数既可以实现体积大的细胞计数，也可以实现微小细胞计数。

[0026] (3)本发明使用的是玻璃微流通道，不会衰减SAW；而聚合物微流通道虽然具有易于加工、低毒性等优点，但是其会衰减SAW，限制了声能传递到细胞流体中，造成大量的能量集中于微流通道表面。

[0027] (4)本发明通过测试传输参数的方式变现出来，达到了实时测试数据，用时较短，避免了复杂的人工操作，提高了技术精度，在根据目标细胞数量判断病情以及药物筛选等方面具有深远的影响。

实施方案

[0037] 下面结合附图对本发明作进一步说明。

[0038] 基于表面声波技术的细胞计数方法，具体如下：

[0039] 1)在压电衬底上制作具有叉指电极的声表面波器件。

[0040] 2)在声表面波器件的声表面波传播路径上制作微流通道。

[0041] 3)通过微量泵连接注射器输送细胞流体(培养液和细胞的混合物)进入微流通道，利用鞘流技术驱动细胞流体实现聚焦，使微流通道中的细胞呈现单排列，细胞间保持距离，依次流过微流通道。

[0042] 4)声表面波器件与检测仪器连接，检测仪器工作后，测出传输参数，通过绘制传输参数在谐振频率点的值随着时间变化的图像，得到细胞数量信息。

[0043] 压电衬底材料选用铌酸锂晶体，叉指电极材料选用铝，微流通道材料选用玻璃，通过步骤1)和2)制作出具有微流通道的声表面波器件，在该声表面波器件的微流通道中注射细胞流体后，检测仪器(选用网络分析仪)进行分析，分析结果如图1(a)和(b)所示。图1(a)表示的是微流通道中有细胞和无细胞时的不同传输参数曲线；图1(b)表示的是传输参数在该声表面波器件谐振频率点时的值随时间的变化曲线，其中t0‑t1段表示的是通道中无细胞只含有细胞培养液的情况，t1‑t2段表示的是通道中出现了一颗细胞的情况，通过统计图中尖点个数，实现细胞计数。

[0044] 在压电衬底上制作具有叉指电极的声表面波器件，制作过程如下：

[0045] 步骤①、选用铌酸锂(LiNbO3)晶体作为压电衬底，先对压电衬底使用丙酮在超声机内反复清洗，再对压电衬底使用乙醇在超声机内反复清洗，然后用氮气烘干以备用，如图3(a)所示。

[0046] 步骤②、在步骤①的基础上，使用旋转涂胶机在压电衬底表面涂上一层光刻胶(负胶)，如图3(b)所示。再放在热板上烘烤5分钟。

[0047] 步骤③在步骤②的基础上将掩模版一覆在光刻胶上，进行能量密度为5mw/cm2的紫外光曝光后去除掩模版一放入显影液显影，把显影后的压电衬底放在烤箱中烘烤2min去掉残余液体，如图3(c)所示。其中，掩模版一的形状如图2(a)和图2(b)所示，图2(a)为制作具有聚焦型叉指电极的声表面波器件的掩模版一形状，图2(b)为制作具有平行型叉指电极的声表面波器件的掩模版一形状。

[0048] 步骤④、在步骤③的基础上通过磁控溅射的方法在压电衬底上方生长一层100nm厚的铝(AL)膜，如图3(d)所示。

[0049] 步骤⑤、在步骤④的基础上，通过将镀完铝膜后的压电衬底放在丙酮中浸泡，将多余的光刻胶去掉，形成叉指电极，如图3(e)所示。

[0050] 制作完成的声表面波器件如图4(a)和图4(b)所示，图4(a)为具有聚焦型叉指电极的声表面波器件的平面图，图4(b)为具有平行型叉指电极的声表面波器件的平面图，1和2为一对叉指电极，3为压电衬底。

[0051] 声表面波器件是一种精密的加工技术，必须在超净间的环境中进行，空气中存在较大尘埃颗粒时，会在制成的声表面波中产生缺陷，导致器件失效。

[0052] 玻璃材料微流通道的制作如下：

[0053] 步骤(1)、选用玻璃作为通道衬底，先对通道衬底使用丙酮在超声机内反复清洗，再对通道衬底使用乙醇在超声机内反复清洗，然后用氮气烘干以备用，如图6(a)所示。

[0054] 步骤(2)、在步骤(1)的基础上，在通道衬底表面沉积一层Cr膜作为牺牲层，如图6(b)所示。

[0055] 步骤(3)、在步骤(2)的基础上，使用旋转涂胶机在Cr膜表面涂上一层光刻胶(正胶)，如图6(c)所示，再放在热板上烘烤5分钟。

[0056] 步骤(4)、在步骤(3)的基础上将掩模版二覆在光刻胶上，如图6(d)所示。其中，掩模版二的形状如图5所示。

[0057] 步骤(5)、在步骤(4)的基础上，进行能量密度为5mw/cm2的紫外光曝光后去除掩模版二放入显影液中显影。如图6(e)所示。

[0058] 步骤(6)、在步骤(5)的基础上，用化学腐蚀剂除去曝光部位的Cr膜。如图6(f)所示。

[0059] 步骤(7)、在步骤(6)的基础上用氢氟酸对暴露出来的通道衬底进行刻蚀得到微流通道。如图6(g)所示。

[0060] 步骤(8)、在步骤(7)的基础上去掉剩余的光刻胶和Cr膜，如图6(h)所示。

[0061] 制作好的玻璃微流通道如图7所示，其中A,B,C为三个交叉的玻璃管道，作为进样管道，图中白点为溶液中的细胞。

[0062] 微流通道的制作通常有两种方案，微流通道材料可以选用玻璃或者聚合物。第一种是利用刻蚀技术在压电衬底上刻蚀沟道形成微流通道，本实施例采用第一种方案。第二种是将制作好的微流通道粘合在声表面波器件上。第二种方案中，如果选用聚合物材料，则利用氧等离子键合技术粘在声表面波器件上，或利用阳极键合方法粘在声表面波器件上；如果选用玻璃材料，则在微流通道下方涂上低粘度、低压缩性、可UV固化的环氧树脂胶，并在UV光照射下交联环氧树脂形成粘合。

[0063] 细胞计数系统的搭建如下：

[0064] 如图8(a)和图8(b)所示，细胞计数系统包括网络分析仪和pcb基板；将制备好的声表面波器件固定在PCB基板上，将声表面波器件的端口一用射频线接上网络分析仪上的端口一，声表面波器件的端口二用射频线接上网络分析仪的端口二；用微量泵连接三个注射器，三个注射器分别向玻璃管道A的入流口a通入细胞培养液，玻璃管道B的入流口b通入细胞与培养液的混合物，玻璃管道C的入流口c通入细胞培养液；玻璃管道A和玻璃管道C的出流口均连通玻璃管道B中部的汇流口e，玻璃管道B的出流口为d，玻璃管道A中细胞培养液、玻璃管道B中的细胞与培养液混合物以及玻璃管道C的细胞培养液在玻璃管道B的汇流口汇流后由玻璃管道B的出流口输出。通过控制流入玻璃管道A、B、C中液体的流速，在玻璃管道A和玻璃管道C的鞘流聚焦作用下，使得汇流口e到玻璃管道B的出流口d的这段管道中的细胞呈现单排列，细胞间保持一定的距离。连接端口一的叉指电极接上射频信号后，产生声表面波(SAW)，并通过压电衬底表面和微流通道，被端口二的叉指电极接收，从而网络分析仪测得声表面波器件的传输参数(谐振频率点特征参量)。由于汇流口e到玻璃管道B的出流口d的微流通道中，是每隔一段时间流入一个细胞(图8(a)和图8(b)中的白点代表流入微流通道的细胞)，当液体中不含细胞时，液体吸收的能量多，测得传输参数在谐振频率点的值S21＝a(a为一个常数)，当微流通道中的液体含有细胞的时候，由于细胞膜的作用，被吸收的能量变小，测得传输参数在谐振频率点的值S21＝b(b为一个常数)，由于a≠b，通过绘制传输参数S21在谐振频率点的值随着时间变化的图像，并统计图像中尖点的个数即可实现细胞计数。

[0065] 另外，本发明若用于粒子计数，则计数原理是基于同等体积的磷酸盐缓冲液和同等体积的粒子与磷酸盐缓冲液混合物吸收声波的能量不同，接收端叉指电极所获得的信号也不同，测得传输参数在谐振频率点的值便不同；通过绘制传输参数在谐振频率点的值随着时间变化的图像，并统计图像中尖点的个数即实现粒子计数。

[0066] 以上对本发明所提供的一种用于细胞计数的方法，对制作方法进行了介绍，且结合附图，进一步阐述本发明以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

附图说明

[0028] 图1(a)为微流通道中有细胞和无细胞时的不同传输参数曲线图；

[0029] 图1(b)为传输系数在谐振频率点的值随时间变化的脉冲波形图；

[0030] 图2(a)和图2(b)分别为本发明制作具有聚焦型叉指电极和具有平行型叉指电极的声表面波器件的掩模版形状示意图；

[0031] 图3(a)、图3(b)、图3(c)、图3(d)和图3(e)分别为本发明声表面波器件制备工艺中压电衬底准备、匀胶、光刻显影、溅射铝膜和剥离光刻胶的示意图；

[0032] 图4(a)和图4(b)分别为本发明制作的具有聚焦型叉指电极和具有平行型叉指电极的声表面波器件的平面图；

[0033] 图5为本发明玻璃微流通道的掩模版形状示意图；

[0034] 图6(a)、图6(b)、图6(c)、图6(d)、图6(e)、图6(f)、图6(g)和图6(h)分别为本发明玻璃微通道制备工艺中通道衬底准备、镀膜、匀胶、覆掩模版、光刻显影、化学腐蚀、刻蚀和剥离光刻胶及Cr膜的示意图；

[0035] 图7为本发明玻璃微流通道的平面图；

[0036] 图8(a)和图8(b)分别为采用具有聚焦型叉指电极和具有平行型叉指电极的声表面波器件搭建的细胞计数系统结构图。

1基于表面声波技术的细胞或粒子计数方法