实施方案
[0019] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0020] 实施例：一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，制备流程如下：赤魟软骨→组织破碎→盐酸胍抽提→超滤→细胞膜固定相吸附→HPLC指纹图谱比较分析→血管生成抑制因子。
[0021] 1）细胞膜悬液的制备：取血管内皮生长因子特异性受体（VEGFR）高表达的、处于对数生长期的肝癌细胞Bel-7402，采用MEM培养基（含10% 的胎牛血清），于37℃、5 % CO2培养7
箱内培养，当细胞计数达到10时，应用胰蛋白酶将细胞消化下来，于4℃、1000 r/min离心
10 min，取沉淀用生理盐水清洗2遍后，加入到50 mM的Tris-HCl溶液超声30 min破碎细胞。
将悬液于1000 r/min、4℃条件下离心5 min，取上清液于12000 r/min、4℃ 条件下离心25 min，得到细胞膜沉淀，用生理盐水重悬，清洗3 次后，加入生理盐水至膜蛋白含量为2.2 mg/mL，即为细胞膜悬液；
[0022] 2）细胞膜固定相的制备：取预处理的大孔球形硅胶加入到低温（4℃）反应管中，在振荡条件下，按照固液比1g：25 mL将细胞膜悬液加入到反应管中，吸附15 h，超声研磨25 min后，于4000 r/min离心15 min，收集沉淀，用生理盐水洗涤3次，除去未结合的细胞膜，得Bel-7402细胞膜固定相。
[0023] 3）赤魟软骨蛋白的制备与酶解：将破碎匀浆的赤魟软骨按固液比1 g : 15 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 ℃、振荡抽提48 h后，于4 ℃、10000 r/min离心15 min，取上清液装入截留分子量为1 kDa的透析袋中，用双蒸水于4 ℃以下透析24 h，透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白；将赤魟软骨蛋白按固液比1 g : 20 mL加入到巴比妥钠-盐酸缓冲液（pH 7.0）中，按照赤魟软骨蛋白质量的2%加入中性蛋白酶（酶活力≥1.0×105 U/g），酶解温度60 ℃，酶解4 h，将溶液升温至95℃，并于此温度保持10 min，温度降至37 ℃，用NaOH调pH至7.8，按照赤魟软骨蛋白质量的2%加入胰蛋白酶（酶活力≥1.9×104 U/g），酶解温度为37℃，酶解4 h，将溶液升温至95℃，并于此温度保持15 min，于10000 r/min、4℃ 条件下离心20 min，取上清液，上清液采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，置于截留分子量为100的透析袋中，三蒸水透析24 h，冻干，得酶解物活性组分。
[0024] 4）赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备：将酶解物活性组分用三蒸水配成0.05 mg/mL的溶液，将细胞膜固定相按照固液比1 g:10 mL加入到活性组分溶液中，37℃保温孵育2 h后，4000 r/min离心15 min，留取上清液，沉淀用三蒸水淋洗8次，合并洗涤液和上清液，冻干，即为细胞膜吸附剩余物；利用RP-HPLC（进样量为5～10 μL；色谱柱为Amethyst C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；洗脱条件为0～40 min内乙腈浓度由10%匀速升至50%；流速0.4 mL/min；紫外检测波长为215 nm）建立酶解物活性组分和细胞膜吸附剩余物的指纹图谱，纯化制备消失或峰面积显著减小的差异峰，并对其进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用测定，得赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子P3（图1）。
[0025] 5）结构检测：收集对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最强的多肽P3，经检测为单一峰，经蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp（GYICPQW），ESI-MS检测分子量为865.98 Da。
[0026] 将制得的Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp（GYICPQW）进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制活性测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等“改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术－无气室孵育法”（记载于《中山大学学报（自然科学版）》，2003年第2册（第42卷）： 第126-128页）。结果表明，赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子GYICPQW显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成并呈剂量依赖关系（表1）。
[0027] 表1 赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的抑制作用
[0028]
[0029] 将制得的赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子GYICPQW进行促血管生成因子表达影响的测定，测定方法参考孙晓佳、张月英、贾青等“蝎毒多肽提取物联合化疗抑制Lewis肺癌血管生成实验研究”（记载于《中国中药杂志》，2011年第12期（第36卷）：第1644-1649页）。给荷Lewis 肺癌小鼠腹腔注射赤魟血管生成抑制因子GYICPQW (20.0mg/kg·d×14)，取肺癌组织进行免疫组化检查，检测结果表明：赤魟软骨血管生成抑制因子GYICPQW对血管内皮细胞生长因子(VEGF) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 和血小板衍生生长因子(PDGF) 等三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用(表2) 。
[0030] 表2 赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子对促血管生成因子表达的抑制作用[0031]
[0032] 尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
