[0036] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0037] 实施例1
[0038] (1)巴戟天内生真菌Cytospora rhizophorae A761的分离纯化和鉴定
[0039] 本发明的巴戟天内生真菌Cytospora rhizophorae A761是2015年1月从采自广东省高要 市的巴戟天植物的叶中分离得到的，经ITS序列分析鉴定，GenBank基因登录号为： KU529867，经blast比对，同源分析，鉴定该菌株属于Cytospora属真菌，命名为Cytospora rhizophorae A761。
[0040] (2)巴戟天内生真菌Cytospora rhizophorae A761的发酵培养物制备
[0041] ①配制马铃薯葡萄糖液体培养基：每升培养基是通过以下方法配制的：用500mL水 煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、维生素B1 10mg，用水补足至1000mL，121℃高压灭菌20min，冷却待用。
[0042] ②挑取适量的巴戟天内生真菌Cytospora rhizophorae A761的菌丝接种于马铃薯葡萄 糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液；然后将种子液按体积 分数10％的接种量接种于装有500mL马铃薯葡萄糖液体培养基的1000mL三角瓶中，共 发酵100L，在28℃、120r/min条件下培养7天，制得巴戟天内生真菌Cytospora rhizophorae A761的发酵培养物。
[0043] (3)化合物cytorhizin B和cytorhizin C的制备
[0044] 取75L巴戟天内生真菌Cytospora rhizophorae A761的发酵培养物经8层纱布过滤得到 发酵液和菌丝体，发酵液经大孔树脂D101柱，先用水洗掉培养基残渣，再用体积分数95％ 乙醇水溶液等度洗脱，收集95％乙醇水溶液洗脱的组分，减压浓缩得浸膏37g。
[0045] 将浸膏经C18反相柱层析，用甲醇‑水作为洗脱剂，从体积比60:40至100:0梯度洗脱， 收集甲醇：水体积比为60:40洗脱下来的馏分Fr.2(8.92g)。馏分Fr.2经硅胶柱层析，以正 己烷：乙酸乙酯体积比为20:1,10:1,5:1,2:1,1:1,0:1进行梯度洗脱，经TLC板合并相同主 点得到9个流分，分别为Fr.2‑1‑Fr.2‑9。收集正己烷：乙酸乙酯体积比5:1洗脱的且经TLC 以展开剂为正己烷：乙酸乙酯＝5:1v/v，rf值为0.3‑0.6的组分Fr.2‑6(486mg)；收集正己烷： 乙酸乙酯体积比5:1洗脱的且经TLC以展开剂正己烷：乙酸乙酯＝5:1v/v，rf值为0.2‑0.3 的组分Fr.2‑7(3.07g)；
[0046] 将流分Fr.2‑6再经硅胶柱层析，以正己烷：乙酸乙酯的体积比为20:1,10:1,5:1,2:1,1:1, 0:1梯度洗脱得到6个组分，分别为Fr.2.6.1‑Fr.2.6.6，将正己烷：乙酸乙酯体积比为2:1洗 脱得到的组分Fr.2.6.6经进一步的半制备HPLC，在色谱柱为YMC‑pack ODS/AQ，流动相 为体积比75:25的乙腈/水，流速为3mL/min的色谱条件下纯化，收集保留时间为
17.8min 的组分，得到化合物1(化合物cytorhizin B，8.0mg)；
[0047] 将流分Fr.2‑7再经凝胶柱层析Sephadex LH‑20，以二氯甲烷：甲醇体积比1:1作为洗脱 剂洗脱，经TLC板合并主点得到10个亚组分，分别为Fr.2‑7‑1‑Fr.2‑7‑10，收集经TLC以展 开剂为正己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v，rf为0.5‑0.8得到的亚组分Fr.2‑7‑5，将Fr.2‑7‑5经进一步 的硅胶柱层析，以正己烷：乙酸乙酯体积比8:1→1:1梯度洗脱，得到五个亚组分 Fr.2‑7‑5‑1‑Fr.2‑7‑5‑5，将正己烷：乙酸乙酯体积比5:1洗脱的亚组分Fr.2‑7‑5‑2经进一步的半 制备HPLC，在色谱柱为YMC‑pack ODS/AQ柱，流动相为体积比60:40的乙腈/水，流速为 3mL/min的色谱条件下纯化，收集保留时间为15.8min的组分，制得化合物2(化合物 cytorhizin C，3.0mg)。
[0048] (4)化合物cytorhizin B和cytorhizin C的结构鉴定
[0049] 1H‑NMR、13C‑NMR、HMBC核磁共振谱图用Bruker Advance‑600核磁共振光谱仪测定， 以四甲基硅烷(TMS)为内标；ESI‑MS数据用Bruker maXis Q‑TOF型质谱仪测定，其结 构鉴定如下：
[0050] 如图1‑12所示，图1是化合物1(cytorhizin B)的1H‑NMR谱；图2是化合物113
(cytorhizin B)的 C‑NMR谱；图3是化合物1(cytorhizin B)的COSY谱；图4是化合物1(cytorhizin B)的HSQC谱；图5是化合物1(cytorhizin B)的HMBC谱；图6是化合物1(cytorhizin B)的HR‑ESIMS谱。
[0051] 图7是化合物2(cytorhizin C)的1H‑NMR谱；图8是化合物2(cytorhizin C)的13C‑NMR 谱；图9是化合物2(cytorhizin C)的COSY谱；图10是化合物2(cytorhizin C)的HSQC 谱；图11是化合物2(cytorhizin C)的HMBC谱；图12是化合物2(cytorhizin C)的HR‑ESIMS 谱。
[0052] 化合物1为白色固体；根据HR‑ESIMS m/z 419.1250[M+H]+，计算值为419.1256，确 1
定化合物1的分子式为C22H23ClO6，不饱和度为11；H‑NMR谱显示化合物1中包括一个 五取代
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的苯环和一个三取代的的苯环。C‑NMR谱显示有22个碳信号(表2)，包括4个 甲基，2个亚甲基，5个次甲基以及11个季碳，进一步通过分析化合物1的二维谱图确定 了化合物1的平面结构。
[0053] 化合物2为白色固体；根据高分辨质谱(HR‑ESIMS)m/z 415.1750[M+H]+，计算值 为415.1751，确定化合物的分子式为C23H27O7，不饱和度为11；通过分析其1D和2D谱图 发现化合物2的谱图与化合物1的谱图具有极大的相似度，化合物2应具有化合物1相同 的母核结构，通过仔细分析化合物2的HMBC和COSY相关谱图推测出化合物2与化合物 1的主要区别在于化合物的17元氧杂环的末端氯原子(化合物1)被甲氧基(化合物2)替 代，因此，确定了化合物2的结构。
[0054] 表2化合物cytorhizin B和cytorhizin C的核磁数据(600MHz/150MHz,δin ppm,J in Hz)
[0055]
[0056]
[0057] 注：a溶剂为氘代丙酮；b溶剂为氘代氯仿。
[0058] 经过上述方法分离的目标化合物1和2分别命名为化合物cytorhizin B和cytorhizin C， 其结构式如式(I)所示：
[0059]
[0060]
[0061] 实施例2
[0062] 采用SRB法[SkehanP,Storeng R,Dominic S.New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer‑drug screening[J].J Natl Cance Inst,]测试化合物cytorhizin B和cytorhizin C的抗 肿瘤活性。
[0063] 1、试验用试剂：将本发明制备的化合物cytorhizin B和cytorhizin C分别用二甲基亚砜 (DMSO)溶解得浓度为10mg/mL的母液，再用RPMI‑1640培养基稀释至所需浓度。阳性 对照为顺铂水溶液。
[0064] 本实验所用肿瘤细胞株为肝癌细胞HepG‑2、NCI‑H460、乳腺癌细胞MCF‑7以及神经 癌细胞SF‑268。
[0065] 2、实验方法：取对数生长期的HepG‑2、NCI‑H460、MCF‑7和SF‑268细胞，用胰酶 消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95％后，用新鲜RPMI‑1640培 养基4
调整细胞浓度为3×10个/mL，细胞接种于96孔板，每孔加入180μL的细胞悬液，并 设3个空白孔调零，于37℃、5％CO2培养箱培养24h。待细胞贴壁后，每孔加入20μL 一定浓度的上述化合物cytorhizins B和cytorhizin C的溶液，阴性对照加20μL RPMI‑1640 培养基，以顺铂作阳性对照。置37℃、5％CO2培养箱中培养72h后，加入50μL 50％冷 三氯醋酸固定细胞，
4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由 1％v/v冰醋酸配制的SRB
4mg/mL溶液100μL/孔，室温中染色30min，去上清，用1％v/v 冰醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入200μL/孔10mmol/mL的Tris溶液，用酶标仪测定 570nm处的吸光值(A)，用以下公式计算药物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率(％)＝(1‑A样品组/A对照组)×100。
[0066] 3、实验结果：cytorhizins B对HepG‑2细胞、NCI‑H460细胞、MCF‑7细胞和SF‑268 细胞的IC50值分别为29.4μM、32.8μM、30.1μM和34.8μM；cytorhizin C对HepG‑2细胞、 NCI‑H460细胞、MCF‑7细胞和SF‑268细胞的IC50值分别为68.6μM、54.7μM、58.6μM和 36.8μM(见下表1)。阳性对照物顺铂对上述四种肿瘤细胞株的IC50值分别为2.4μM、1.6μM、 3.2μM和3.3μM。此结果表明：本发明的化合物cytorhizins B和cytorhizin C具有抗肿瘤活 性。因此，本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用植物内生 微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。
[0067] 表3化合物cytorhizin B和cytorhizin C对癌细胞的抑制效果
[0068]
[0069] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明 的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
