[0041] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0042] 实施例1:
[0043] 1)荧光碳点(CDs)的制备:称取2.00g红薯块茎碎块和6.00g KH2PO4,加入10mL蒸馏水,将混合溶液倒入水热反应釜中密封,置于180℃烘箱中加热10 h,冷却至室温后,取出反应液,超声10min,用0.22μm微孔膜抽滤,得到浅黄色的荧光碳点液体;将得到的溶液用透析袋(截留分子量 1000)透析24 h以除去其他小分子杂质;最后对纯化的碳点溶液进行冷冻干燥,可得到荧光碳点粉末。
[0044] 2)荧光碳点标记蚕丝丝素蛋白二抗的制备:将荧光碳点、碳化二亚胺和二抗加入到10mmol/L的PBS缓冲液中,在室温条件下搅拌2 3 h后,用PBS缓冲液对溶液进行多次洗涤~离心,即可得到荧光碳点标记的桑蚕丝素蛋白二抗和柞蚕丝素蛋白二抗。
[0045] 3)称取等质量已被混淆的由桑蚕丝、柞蚕丝和蓖麻蚕丝制作的古代纺织品残片作为样品,小心用去离子水清洗,去除表面污染物,烘干,分别标记为A,B,C三组。
[0046] 4)将A,B,C三组样品以1:100的浴比在含有0.5% Na2PO4和1%C17H35COONa的混合溶液中煮沸30min,进行脱胶处理,共脱胶两次;脱胶之后,样品用去离子水小心搓洗4次以上,放入烘箱干燥。
[0047] 5) 将A,B,C三种古代丝织品残片以1:50的浴比浸入[AMIM]Cl离子液体中,加热反应一定时间,冷却;加入PM13-碱性蛋白酶粉末恒温孵育6h,进行灭酶,得到丝素蛋白/离子液体溶液A、B、C。
[0048] 其中,所述PM13-碱性蛋白酶的制备方法为:向100mL的0.1M的硼酸钠缓冲溶液中加入0.15g碱性蛋白酶和3.75g的MW15000的梳状PEG,在4℃条件下缓慢搅拌1h,再外加50mL 1mmol/L HCl的条件下超滤除去未反应的PM13,重复三次,将滤液进行冷冻干燥,得到PM13-碱性蛋白酶粉末。
[0049] 6)待丝素/离子液体溶液冷却至室温,加入无水乙醇,反复浸泡,会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤,向滤出的丝素蛋白中加入去离子水,反复浸泡后过滤,分别得到丝素蛋白提取液A、B、C;将得到的三种丝素蛋白提取液在4℃条件下用透析袋(截留分子量1000)透析12 h,除去小分子杂质;将透析后的丝素蛋白提取液装入浓缩管中真空浓缩,在3000rpm、温度10℃条件下浓缩丝素蛋白溶液至终体积约为200μL,得到丝素蛋白浓缩液A、B、C。
[0050] 7)SDS-PAGE凝胶电泳:分别量取50μL丝素蛋白浓缩液A、B、C,用CB 9.6缓冲液稀释至5mL,在100℃条件下加热5min,进行变性处理;冷却后至室温后,将三种样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶(上层为浓缩胶,下层为分离胶)加样孔中,在电解槽中加满电解液,电泳完成后,可在成像系统中观察电泳图像。其中,电泳具体操作为:先恒压80V,10min后蛋白进入分离胶,调整恒定电压为120V,20min后电泳完成。本实验中一次制作两张样品胶,记为胶1、胶2。
[0051] 8)电转移:将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的PVDF膜上,夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层,放入湿式转膜装置中,恒流转膜。可得到两张电转移膜,记为膜1、膜2。
[0052] 9)膜成像:电转移完成后,用镊子取出PVDF膜,放入凝胶成像系统中成像,观察蛋白条带转移情况。
[0053] 10)封闭:取出PVDF膜,用15mL的TBS液洗膜5min,用封闭液(5%脱脂奶粉)在室温条件下处理1h。
[0054] 11)免疫处理:用抗体稀释液(TBST液)以1000:1的比例稀释桑蚕丝一抗,将膜1浸没在一抗稀释液中,室温条件下摇床孵育1h;取出膜1后用TBST液洗膜,之后浸入10mL以一定比例稀释的荧光碳点标记的桑蚕丝二抗液中室温条件下孵育1.5 h。膜2用柞蚕丝抗体进行同样处理。
[0055] 12)发光显色:直接将免疫处理后的膜1、膜2在凝胶成像系统中成像,利用荧光碳点在紫外光照射下发射荧光的性能,得到免疫印迹图像。膜1中得到荧光条带为桑蚕丝纺织品残片,膜2中得到荧光条带的为柞蚕丝纺织品残片,则另一样品即为蓖麻蚕丝纺织品残片。
[0056] 实施例2:
[0057] 1)荧光碳点(CDs)的制备:称取2.00g红薯块茎碎块和6.00g KH2PO4,加入10mL蒸馏水,将混合溶液倒入水热反应釜中密封,置于200℃烘箱中加热13 h,冷却至室温后,取出反应液,超声10min,用0.22μm微孔膜抽滤,得到浅黄色的荧光碳点液体;将得到的溶液用透析袋(截留分子量 1000)透析24 h以除去其他小分子杂质;最后对纯化的碳点溶液进行冷冻干燥,可得到荧光碳点粉末。
[0058] 2)荧光碳点标记蚕丝素蛋白二抗的制备:将荧光碳点、碳化二亚胺和二抗加入到10mmol/L的PBS缓冲液中,在室温条件下搅拌2.5 h后,用PBS缓冲液对溶液进行多次洗涤离心,即可得到荧光碳点标记的桑蚕丝素蛋白二抗和柞蚕丝素蛋白二抗。
[0059] 3)称取等质量已被混淆的由桑蚕丝、柞蚕丝和蓖麻蚕丝制作的古代纺织品残片作为样品,小心用去离子水清洗,去除表面污染物,烘干,分别标记为A,B,C三组。
[0060] 4)将A,B,C三组样品以1:100的浴比在含有0.5% Na2PO4和1%C17H35COONa的混合溶液中煮沸30min,进行脱胶处理,共脱胶两次;脱胶之后,样品用去离子水小心搓洗4次以上,放入烘箱干燥。
[0061] 5) 将A,B,C三种古代丝织品残片以1:50的浴比浸入[AMIM]Cl离子液体中,加热反应一定时间,冷却;加入PM13-碱性蛋白酶粉末恒温孵育6h,进行灭酶,得到丝素蛋白/离子液体溶液A、B、C。
[0062] 其中,所述PM13-碱性蛋白酶的制备方法为:向100mL的0.1M的硼酸钠缓冲溶液中加入0.15g碱性蛋白酶和3.75g的MW15000的梳状PEG,在4℃条件下缓慢搅拌1h,再外加50mL 1mmol/L HCl的条件下超滤除去未反应的PM13,重复三次,将滤液进行冷冻干燥,得到PM13-碱性蛋白酶粉末。
[0063] 6)待丝素/离子液体溶液冷却至室温,加入无水乙醇,反复浸泡,会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤,向滤出的丝素蛋白中加入去离子水,反复浸泡后过滤,分别得到丝素蛋白提取液A、B、C;将得到的三种丝素蛋白提取液在4℃条件下用透析袋(截留分子量1000)透析12 h,除去小分子杂质;将透析后的丝素蛋白提取液装入浓缩管中真空浓缩,在3000rpm、温度10℃条件下浓缩丝素蛋白溶液至终体积约为200μL,得到丝素蛋白浓缩液A、B、C。
[0064] 7)SDS-PAGE凝胶电泳:分别量取50μL丝素蛋白浓缩液A、B、C,用CB 9.6缓冲液稀释至5mL,在100℃条件下加热5min,进行变性处理;冷却后至室温后,将三种样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶(上层为浓缩胶,下层为分离胶)加样孔中,在电解槽中加满电解液,电泳完成后,可在成像系统中观察电泳图像。其中,电泳具体操作为:先恒压80V,10min后蛋白进入分离胶,调整恒定电压为120V,20min后电泳完成。本实验中一次制作两张样品胶,记为胶1、胶2。
[0065] 8)电转移:将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的PVDF膜上,夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层,放入湿式转膜装置中,恒流转膜。可得到两张电转移膜,记为膜1、膜2。
[0066] 9)膜成像:电转移完成后,用镊子取出PVDF膜,放入凝胶成像系统中成像,观察蛋白条带转移情况。
[0067] 10)封闭:取出PVDF膜,用15mL的TBS液洗膜5min,用封闭液(5%脱脂奶粉)在室温条件下处理1h。
[0068] 11)免疫处理:用抗体稀释液(TBST液)以1000:1的比例稀释桑蚕丝一抗,将膜1浸没在一抗稀释液中,室温条件下摇床孵育1.5 h;取出膜1后用TBST液洗膜,之后浸入10mL以一定比例稀释的荧光碳点标记的桑蚕丝二抗液中室温条件下孵育1.5 h。膜2用柞蚕丝抗体进行同样处理。
[0069] 12)发光显色:直接将免疫处理后的膜1、膜2在凝胶成像系统中成像,利用荧光碳点在紫外光照射下发射荧光的性能,得到免疫印迹图像。膜1中得到荧光条带为桑蚕丝纺织品残片,膜2中得到荧光条带的为柞蚕丝纺织品残片,则另一样品即为蓖麻蚕丝纺织品残片。
[0070] 实施例3:
[0071] 1)荧光碳点(CDs)的制备:称取2.00g红薯块茎碎块和6.00g KH2PO4,加入10mL蒸馏水,将混合溶液倒入水热反应釜中密封,置于220℃烘箱中加热15 h,冷却至室温后,取出反应液,超声10min,用0.22μm微孔膜抽滤,得到浅黄色的荧光碳点液体;将得到的溶液用透析袋(截留分子量 1000)透析24 h以除去其他小分子杂质;最后对纯化的碳点溶液进行冷冻干燥,可得到荧光碳点粉末。
[0072] 2)荧光碳点标记蚕丝素蛋白二抗的制备:将荧光碳点、碳化二亚胺和二抗加入到10mmol/L的PBS缓冲液中,在室温条件下搅拌3 h后,用PBS缓冲液对溶液进行多次洗涤离心,即可得到荧光碳点标记的桑蚕丝素蛋白二抗和柞蚕丝素蛋白二抗。
[0073] 3)称取等质量已被混淆的由桑蚕丝、柞蚕丝和蓖麻蚕丝制作的古代纺织品残片作为样品,小心用去离子水清洗,去除表面污染物,烘干,分别标记为A,B,C三组。
[0074] 4)将A,B,C三组样品以1:100的浴比在含有0.5% Na2PO4和1%C17H35COONa的混合溶液中煮沸30min,进行脱胶处理,共脱胶两次;脱胶之后,样品用去离子水小心搓洗4次以上,放入烘箱干燥。
[0075] 5) 将A,B,C三种古代丝织品残片以1:50的浴比浸入[AMIM]Cl离子液体中,加热反应一定时间,冷却;加入PM13-碱性蛋白酶粉末恒温孵育6h,进行灭酶,得到丝素蛋白/离子液体溶液A、B、C。
[0076] 其中,所述PM13-碱性蛋白酶的制备方法为:向100mL的0.1M的硼酸钠缓冲溶液中加入0.15g碱性蛋白酶和3.75g的MW15000的梳状PEG,在4℃条件下缓慢搅拌1h,再外加50mL 1mmol/L HCl的条件下超滤除去未反应的PM13,重复三次,将滤液进行冷冻干燥,得到PM13-碱性蛋白酶粉末。
[0077] 6)待丝素/离子液体溶液冷却至室温,加入无水乙醇,反复浸泡,会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤,向滤出的丝素蛋白中加入去离子水,反复浸泡后过滤,分别得到丝素蛋白提取液A、B、C;将得到的三种丝素蛋白提取液在4℃条件下用透析袋(截留分子量1000)透析12 h,除去小分子杂质;将透析后的丝素蛋白提取液装入浓缩管中真空浓缩,在3000rpm、温度10℃条件下浓缩丝素蛋白溶液至终体积约为200μL,得到丝素蛋白浓缩液A、B、C。
[0078] 7)SDS-PAGE凝胶电泳:分别量取50μL丝素蛋白浓缩液A、B、C,用CB 9.6缓冲液稀释至5mL,在100℃条件下加热5min,进行变性处理;冷却后至室温后,将三种样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶(上层为浓缩胶,下层为分离胶)加样孔中,在电解槽中加满电解液,电泳完成后,可在成像系统中观察电泳图像。其中,电泳具体操作为:先恒压80V,10min后蛋白进入分离胶,调整恒定电压为120V,20min后电泳完成。本实验中一次制作两张样品胶,记为胶1、胶2。
[0079] 8)电转移:将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的PVDF膜上,夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层,放入湿式转膜装置中,恒流转膜。可得到两张电转移膜,记为膜1、膜2。
[0080] 9)膜成像:电转移完成后,用镊子取出PVDF膜,放入凝胶成像系统中成像,观察蛋白条带转移情况。
[0081] 10)封闭:取出PVDF膜,用15mL的TBS液洗膜5min,用封闭液(5%脱脂奶粉)在室温条件下处理1h。
[0082] 11)免疫处理:用抗体稀释液(TBST液)以1000:1的比例稀释桑蚕丝一抗,将膜1浸没在一抗稀释液中,室温条件下摇床孵育2 h;取出膜1后用TBST液洗膜,之后浸入10mL以一定比例稀释的荧光碳点标记的桑蚕丝二抗液中室温条件下孵育1.5 h。膜2用柞蚕丝抗体进行同样处理。
[0083] 12)发光显色:直接将免疫处理后的膜1、膜2在凝胶成像系统中成像,利用荧光碳点在紫外光照射下发射荧光的性能,得到免疫印迹图像。膜1中得到荧光条带为桑蚕丝纺织品残片,膜2中得到荧光条带的为柞蚕丝纺织品残片,则另一样品即为蓖麻蚕丝纺织品残片。
[0084] 本发明中所用原料、设备,若无特别说明,均为本领域的常用原料、设备;本发明中所用方法,若无特别说明,均为本领域的常规方法。
[0085] 以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换,均仍属于本发明技术方案的保护范围。