[0017] 以下结合实施例和附图作进一步详细描述：
[0018] 实施例1：鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法，包括以下步骤：
[0019] 1)鲻鱼鱼鳞的预处理：取鲻鱼鱼鳞，按照料液比1g:8mL向鲻鱼鱼鳞中加0.1mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡6h，过滤，脱除非胶原蛋白，处理后鱼鳞用蒸馏水反复洗涤至pH为6.5，沥干，按照料液比1g:13mL加入0.5mol/L EDTA溶液（pH为7.4），于4℃下浸泡4天，每天更换1次EDTA溶液，脱除鱼鳞中的钙，干燥、粉碎，得脱钙鱼鳞；
[0020] 2)鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备：按照料液比1g:6mL向脱钙鱼鳞中加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡4d，12000g离心20min后取上清液，加入NaCl至溶液终浓度为0.9mol/L，静置75min，15000g离心18min得沉淀物，冷冻干燥即为鲻鱼鱼鳞胶原蛋白；
[0021] 3)鲻鱼鱼鳞的酶解：按照料液比1g:18mL向胶原蛋白中加入超纯水，用HCl调溶液pH到2.0，按照胶原蛋白质量的1.1%向溶液中加入胃蛋白酶（酶活力≥1.6×105U/g），酶解4h后，将溶液升温至90℃，并于此温度保持12min后，冷却至室温，用NaOH调溶液pH到9.5，按照蛋白质量的1.2%向溶液中加入碱性蛋白酶（2.0×105U/g），于温度48℃下酶解3.5h，得酶解产物；
[0022] 4)鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备：将制备的蛋白酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有9倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用6倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用4倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇，经冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
[0023] 其中，凝胶柱层析过程为：将上述胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物，如图1所示。
[0024] 反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化过程为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成50μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（所述RP-HPLC条件为：进样量15μL；色谱柱为Zorbax C18（250×4.6mm，5μm）；流动相：40%甲醇；洗脱速度0.9mL/min；紫外检测波长220nm），根据对铁的螯合活性得一个高铁螯合活性肽，如图2所示；铁螯合肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu，ESI/MS检测分子量为974.12Da，如图3所示。
[0025] 采用邻菲罗啉比色法，测定鲻鱼鱼鳞胶原肽对铁离子的螯合作用：将0.05g样品置于100mL烧杯中，加入2mL浓盐酸，待样品完全溶解后，用蒸馏水定容至100mL容量瓶中，准确吸取5mL样品液于50mL容量瓶中，加入1mol/L的HCl溶液1mL，10%的盐酸羟胺lmL，0.12%邻菲罗啉1mL，然后加入10%醋酸钠5mL，用水稀释至刻度，摇匀，以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510nm波长处测定吸光度，将数值代入标准曲线中计算出铁结合量。
[0026] 标准曲线的制作：吸取10μg/mL铁的标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加入lmol/L的HCl溶液1mL，10%的盐酸羟胺lmL，0.12%邻菲罗啉1mL，然后加入10%醋酸钠5mL，用水稀释至刻度，摇匀，以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，得标准曲线公式为：y =0.1673x+0.009，R2 =0.9999。
[0027] 测定结果表明：纯化得到的铁螯合胶原肽Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu对铁离子的螯合能力为81.06μg/mg，与蛋白酶解产物（42.73μg/mg）相比其对铁的螯合能力有了较大提高。
[0028] 实施例2：一种氨基酸序列为Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽在制备补铁保健品中的用途，具体过程为：取12份香菇、20份乳酸亚铁、16份黄豆以及9份茯苓在60℃蒸煮24min，冷却至55℃，加入5份茶多酚和0.1份鲻鱼鱼鳞铁螯合肽，接着在25W下超声15s，再加入4份硒化卡拉胶，充分混匀，制粒得补铁保健品。工艺简单，原料易得，成本较低，制备的补铁保健品安全性高，能够有效促进人体对铁的吸收，具有良好的补铁效果。
[0029] 实施例3：一种氨基酸序列为Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽在制备补铁保健品中的用途，具体过程为：取12份香菇、24份乳酸亚铁、17份黄豆以及11份茯苓在70℃蒸煮26min，冷却至57℃，加入6份茶多酚和0.14份鲻鱼鱼鳞铁螯合肽，接着在26W下超声17s，再加入0.01份戊酸乙酯以及0.013份二巯基丁二酸，在30W下超声40s，最后加入9份硒化卡拉胶，充分混匀，制粒得补铁保健品。工艺简单，原料易得，成本较低，制备的补铁保健品安全性高，具有良好的补铁效果；所加入的戊酸乙酯、二巯基丁二酸与茶多酚具有协同作用，提高了螯合肽与铁离子反应生成螯合物的速率，增大了体内螯合物的含量，使更多的铁离子能够以螯合物的形式通过肠黏膜，进一步提高了人体对铁离子的吸收率。
[0030] 实施例4：一种氨基酸序列为Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽在制备补铁保健品中的用途，具体过程为：取13份香菇、27份乳酸亚铁、18份黄豆以及11份茯苓在100℃蒸煮30min，冷却至60℃，加入8份茶多酚和0.16份鲻鱼鱼鳞铁螯合肽，接着在30W下超声20s，再加入9份硒化卡拉胶，充分混匀，制粒得补铁保健品。本发明制备的补铁保健品，结合养生学理论知识，对原料进行搭配和配比，全面协调地调理机体，使人体能够有效补充铁，调动人体免疫功能，增强人体抵抗疾病的能力。
[0031] 实施例5：一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法，包括以下步骤：
[0032] 1)鲻鱼鱼鳞的预处理：同实施例1的步骤1)一致；
[0033] 2)鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备：按照料液比1g:5mL向脱钙鱼鳞中加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡3d，12000g离心20min后取上清液，加入NaCl至溶液终浓度为0.8mol/L，静置61min，15000g离心15min得沉淀物，冷冻干燥即为鲻鱼鱼鳞胶原蛋白；
[0034] 3)鲻鱼鱼鳞的酶解：按照料液比1g:15mL向胶原蛋白中加入超纯水，用盐酸调溶液pH到2.0，按照胶原蛋白质量的0.8%向溶液中加入胃蛋白酶（酶活力≥1.6×105 U/g），酶解3h后，将溶液升温至90℃，并于此温度保持10min后，冷却至室温，用NaOH调溶液pH到9，按照蛋白质量的1.0%向溶液中加入碱性蛋白酶（2.0×105 U/g），45℃酶解3h，得酶解产物；
[0035] 4)鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备：将制备的蛋白酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有8倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用3倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
[0036] 其中，凝胶柱层析过程为：将上述胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物。
[0037] 反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化过程为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，其中，RP-HPLC条件为：进样量15μL，色谱柱为Zorbax C18（250×4.6mm，5μm），流动相为40%甲醇，洗脱速度为0.8mL/min，紫外检测波长为
220nm。该过程利用反向高效液相色谱制备出超高纯度的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
[0038] 实施例6：一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法，包括以下步骤：
[0039] 1)鲻鱼鱼鳞的预处理：同实施例1的步骤1)一致；
[0040] 2)鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备：按照料液比1g:8mL向脱钙鱼鳞中加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡5d，12000g离心25min后取上清液，加入NaCl至溶液终浓度为1.0mol/L，静置90min，15000g离心20min得沉淀物，冷冻干燥即为鲻鱼鱼鳞胶原蛋白；
[0041] 3)鲻鱼鱼鳞的酶解：按照料液比1g:20mL向胶原蛋白中加入超纯水，用盐酸调溶液pH到2.5，按照胶原蛋白质量的1.2%向溶液中加入胃蛋白酶（酶活力≥1.6×105 U/g），酶解5h后，将溶液升温至95℃，并于此温度保持15min后，冷却至室温，用NaOH调溶液pH到10，按照蛋白质量的1.5%向溶液中加入碱性蛋白酶（2.0×105 U/g），55℃酶解4h，得酶解产物；
[0042] 4)鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备：将制备的蛋白酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用8倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
[0043] 其中，凝胶柱层析过程同实施例1一致。
[0044] 反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化过程为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，其中，RP-HPLC条件为：进样量20μL，色谱柱为Zorbax C18（250×4.6mm，5μm），流动相为40%甲醇，洗脱速度为1.0mL/min，紫外检测波长为
220nm。该过程利用反向高效液相色谱制备出超高纯度的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。
[0045] 以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
