[0029] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0030] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0031] 如图1所示，本发明提供一种具有二肽基肽酶-IV高抑制活性的鼠李糖乳杆菌，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC NO.14571；保藏日期为：2017年8月29日；分类命名为：干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus casei subsp rhamnosus。
[0032] 一种上述的具有二肽基肽酶-IV高抑制活性的鼠李糖乳杆菌的获取方法，包括以下步骤：
[0033] 步骤1、通过筛选获得对二肽基肽酶-IV抑制活性最高的菌株；所述筛选包括样品的制备和对二肽基肽酶-IV抑制活性的测定。
[0034] 步骤2、对筛选获得的菌株进行益生特性评价；所述益生特性评价包括耐酸性试验、耐胆盐试验、对HT-29细胞的黏附性、对模拟胃肠道的耐受性和体外模拟益生菌的消化试验。
[0035] 步骤3、通过16SrDNA基因测序分析确定菌种即得所述对二肽基肽酶-IV具有抑制作用的鼠李糖乳杆菌。
[0036] 一个优选方案中，步骤1中所述样品的制备包括细胞代谢物的制备；所述细胞代谢物的制备的具体过程为：益生菌于MRS培养基中37℃静置培养16-20h后，离心收集菌体，将收集到的菌体用无菌磷酸盐缓冲溶液洗涤2-4次，再重悬于磷酸盐缓冲溶液中，调节菌液浓度至1×106-1×1010cfu/mL，混匀，孵育、离心、收集上清，过滤得到细胞代谢物。
[0037] 一个优选方案中，步骤1中所述样品的制备包括细胞内容物的制备；所述细胞内容物的制备的具体过程为：益生菌于MRS培养基中37℃静置培养16-20h后，离心收集菌体，将收集到的菌体用无菌磷酸盐缓冲溶液洗涤2-4次，再重悬于磷酸盐缓冲溶液中，调节菌液浓6 10
度至1×10-1×10 cfu/mL，混匀，超声破碎，4℃下离心收集上清，过滤得到细胞内容物。
[0038] 一个优选方案中，所述超声破碎的条件为：冰浴条件下，功率200W，以3-5s的脉冲破碎10-14min。
[0039] 一个优选方案中，步骤1中对二肽基肽酶-IV抑制活性的测定主要包括以下步骤：
[0040] 步骤A、取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入20-30μL细胞代谢物或细胞内容物，45-55μL缓冲液，0.5-1.5μL酶，于37℃避光培养8-12min，再加入45-55μL缓冲液，1-3μL物质，用酶标仪37℃反应1-30min，在405nm处每分钟测一次反应液的吸光值。
[0041] 步骤B、用西格列汀做阳性对照，0.1M pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液做空白对照。
[0042] 步骤C、计算相对抑制率，得到对二肽基肽酶-IV抑制活性最高的菌株。
[0043] 上述的具有二肽基肽酶-IV高抑制活性的鼠李糖乳杆菌在制备降糖功能性食品或药品中的应用。
[0044] 在上述方案中，本发明采用体外试验的方法，筛选出对二肽基肽酶-IV抑制能力最强的菌株，所述菌株对酸很敏感，但对胆盐有很好的耐受性，可以很好地在人体内环境中存活，可用于制备降糖功能性食品的开发，具有很好的市场前景。对于含有抑制二肽基肽酶-IV能力的鼠李糖乳杆菌的食品，不但具有辅助降糖的效果，还兼具益生菌的诸多优点，适用于肥胖人群、胰岛素抵抗及糖尿病患者的食品的开发。含有本发明所述鼠李糖乳杆菌的食品无任何不良影响及毒副作用，安全性高。
[0045] 上述具有二肽基肽酶-IV高抑制活性的鼠李糖乳杆菌的具体的获取的方法为：
[0046] 具有二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制作用益生菌的筛选：
[0047] 1、样品的制备
[0048] (1)CFS(cell-free excretory supernatant)
[0049] 益生菌于MRS培养基中37℃静置培养18h后，在4℃下12000r/min，离心15min收集菌体。将收集到的菌体用无菌0.1M PBS(pH6.8)洗涤3次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀。于37℃孵育12h，在4℃下12000r/min，离心15min，收集上清，以0.22μm水系微滤膜过滤得到CFS，-80℃保存。
[0050] (2)CFE(cell-free intracellular extract)
[0051] 益生菌于MRS培养基中37℃静置培养18h后，在4℃下12000r/min，离心15min收集菌体。将收集到的菌体用无菌0.1M PBS(pH6.8)洗涤3次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL，混匀，进行超声破碎。超声破碎的条件为：在冰浴的条件下，功率200W，以3-5s(工作3s，停5s)的脉冲破碎12min。将超声后得到的液体于4℃下，12000r/min，离心15min，收集上清，以0.22μm水系微滤膜过滤得到CFE，-80℃保存。
[0052] 2、DPP-IV抑制活性的测定
[0053] (1)反应体系
[0054] 取酶标板，用微量移液器在反应孔中加入25μL CFS或CFE，49μLbuffer，1μL enzyme，于37℃避光培养10min，再加入49μLbuffer，2μL substance，用酶标仪37℃反应1-30min，在405nm处每分钟测一次反应液的吸光值。用西格列汀做阳性对照，0.1M pH6.8的PBS做空白对照。
[0055] (2)抑制率的计算公式：
[0056] 每次测定时都要做Sample Blank，用样品组的斜率减去空白组的斜率。使用校正后的数值去计算相对抑制率。
[0057] ％相对抑制率
[0058] 斜率＝(FLU2-FLU1)/(T2-T1)
[0059]
[0060] Slope SM：Sample Inhibitor的斜率
[0061] Slope EC：Enzyme Control的斜率
[0062] 表1DPP-IV抑制剂的筛选结果
[0063]
[0064]
[0065] 注：表中ND表示没有检测到抑制作用(Dot detected)
[0066] 由表1可知，有14株益生菌均表现出对DPP-IV的活性有抑制作用，抑制率可以达到5.669％～27.113％。其中，阳性对照组西格列汀的抑制率最高，半数抑制率为44.195％；仅菌株1.6970的CFE有DPP-IV抑制作用，且抑制率很高，为17.789％；10株益生菌的抑制率达到了10％以上，菌株ZNJ05、ST-2、1.1881抑制率较高，分别为27.113％、21.525％、
14.632％，可以达到阳性对照组西格列汀半数抑制率的33％。最后根据表1中的抑制率结果，对DPP-IV抑制活性最高的菌株ZNJ05进行益生特性评价。
[0067] 益生特性评价
[0068] 通过进行益学特性评价，探讨菌株ZNJ05在胃肠道中的存活能力，为这株益生菌能否在人体消化道环境中发挥健康促进作用提供参考。
[0069] 1、耐酸性试验
[0070] 将益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH为2.0，3.0，7.0的MRS肉汤培养基中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL。于37℃孵育3h，收集菌液，根据GB4789.2—2010进行活菌计数。耐受性的计算公式如下：
[0071] Survival rate(％)＝(logN1/logN0)×100 (2)
[0072] N1：经过耐受处理条件下的活菌数
[0073] N0：pH＝6.4(正常)MRS肉汤培养基中的活菌数
[0074] 2、耐胆盐试验
[0075] 将益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH 8.0、含2％胆盐的无菌去离子水中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL。于37℃孵育24h，收集菌液，根据GB4789.2—2010进行活菌计数。计算同公式(2)。
[0076] 3、对HT-29细胞的黏附性
[0077] (1)cFDA-SE对益生菌的荧光标记
[0078] 用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)配制1mmol/L cFDA-SE的贮备液(称5.0mg cFDA-SE溶解于8.969mL的DMSO试剂中)，0.22μm水系微滤膜过滤除菌，-20℃储存备用。
[0079] 将筛选得到的益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃静置培养18h，在4℃的条件下3000×g离心5min，弃上清，收集菌体。将收集到的菌体用无菌PBS洗39
次，重悬于PBS溶液中，调节菌液浓度至1×10 cfu/mL。加入cFDA-SE贮液(1mmol/L)至终浓度为20μmol/L，于37℃避光静置20min，4℃离心(5000×g，10min)，弃上清，收集菌体。再用PBS洗3次，将菌体重悬于PBS溶液中，于488nm的激发波长下进行流式细胞检测，分析cFDA-SE的标记率。
[0080] (2)HT-29细胞的培养
[0081] 将HT-29细胞进行复苏后，按照1:3的比例进行传代，传至新的培养瓶中，观察细胞生长状态。每1-2d换液一次，待细胞汇合度长至90％左右，吸弃培养液，用PBS洗3次，加入1mL 0.25％胰酶，于37℃，5％CO2恒温培养箱中消化2min，吸弃胰酶，加入培养液终止消化，进行细胞计数，调整细胞数至1×105cells/mL，进行铺板，观察细胞生长状态，待培养板中细胞汇合度长至90％-100％时即可进行细菌黏附试验。
[0082] (3)对HT-29细胞的黏附性试验
[0083] 将在24孔板中培养好的HT-29细胞，用PBS洗3次，分别加入500μL的PBS，cFDA-SE标记的益生菌菌悬液；对照组为空白孔+500μL cFDA-SE标记的益生菌菌悬液。于37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，用无菌PBS洗3次。每孔加入350μL 0.25％胰酶，于CO2培养箱中消化10min，待细胞与培养板底部完全脱落，加入150μL细胞培养液终止消化，混匀，取出100μL悬液转入96孔板中，用锡箔纸包好，测其荧光强度。荧光检测条件：激发波长为485nm，发射波长为530nm。黏附率的计算公式如下:
[0084] 细胞黏附率％＝(A-A0)/(A1-A0)×100％ (3)
[0085] 式中：A：HT-29细胞+cFDA-SE标记的细菌菌悬液；
[0086] A0：HT-29细胞+PBS；
[0087] A1：cFDA-SE标记的细菌菌悬液。
[0088] 4、对模拟胃肠道的耐受性
[0089] 参考Versantvoort等的方法配制模拟消化液，充分模拟人体口腔，胃肠道中的消化环境。
[0090] 将益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体分别重悬于人工模拟的唾液(pH 7.0)、胃液(pH 2.0)、肠液(pH 8.0)中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL。于37℃各环境分别孵育
5min、3h、24h，收集菌液，根据GB4789.2—2010进行活菌计数。计算同公式(2)。
[0091] 5、体外模拟益生菌的消化试验
[0092] 将益生菌以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH 7.0的模拟唾液中，调节菌液
9
浓度至为1×10 cfu/mL。于37℃孵育5min，4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体；将收集到的菌体继续重悬于pH 2.0的模拟胃液中，于37℃孵育3h，4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体；最后再将收集的菌体重悬于pH 8.0的模拟肠液中，于37℃孵育24h，收集菌液，根据GB4789.2—2010进行活菌计数。计算同公式(2)。
[0093] 菌株ZNJ05的益生特性如图2所示。
[0094] 结果表明，菌株ZNJ05在pH3.0的酸性条件下培养3h后，存活率为97.61％，大于95％；而在pH为2.0的条件下培养3h后，全部死亡，说明其对酸很敏感；在含2％胆盐的去离子水中培养24h后，存活性良好，且存活率很高，为70.15％，对胆盐有很好的耐受性；采用终浓度为20μmol/L的cFDA-SE对菌株ZNJ05进行标记，用流式细胞仪检测其标记率，可以看出标记率很高，为89.44％；但黏附率很低，仅为1.32％，未达到2.0％。在模拟胃肠道环境中，菌株ZNJ05在模拟唾液、胃液、肠液中的存活率分别为98.46％、36.51％、50.62％，经口腔至胃肠道消化后，存活率为89.61％，可以很好地在模拟体内环境中存活。
[0095] 16S-rDNA基因测序
[0096] 将菌株ZNJ05按4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h。取2mL菌液按细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组。用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测分析DNA的纯度及浓度，用细菌16S rDNA扩增通用引物27F和1492R进行PCR扩增。所述通用引物的碱基序列如表1所示。采用琼脂糖凝胶电泳法对扩增产物进行检测。最后将扩增出的产物交北京华大基因研究中心完成测序。
[0097] 表1细菌16S rDNA扩增通用引物27F和1492R
[0098]
[0099] (1)扩增反应体系
[0100]
[0101] (2)反应条件
[0102]
[0103] 35个循环，最后72℃延伸10min，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳所得结果如图3所示。(Marker条带组成自下而上分别为：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp，电泳方向从上向下。)
[0104] 结果表明，菌株ZNJ05为鼠李糖乳杆菌。
[0105] 实施例1：利用鼠李糖乳杆菌ZNJ05制造具有预防糖尿病功能的酸豆奶[0106] 原料豆浆中加入6％蔗糖，于121℃，灭菌15min，以7％体积百分比的量加入本发明的鼠李糖乳杆菌ZNJ05，在37℃发酵至滴定酸度为0.7％－0.8％(以乳酸计)，冷藏至4℃并冷藏保存即得到具有预防糖尿病功能的酸豆奶。
[0107] 实施例2：利用鼠李糖乳杆菌ZNJ05制造具有预防糖尿病功能的乳酸菌饮料[0108] 将原料乳(脱脂奶、鲜奶、复原奶等)经100℃，灭菌10min后冷却至4℃，加入本发明的鼠李糖乳杆菌ZNJ05，使其浓度达到106cfu/ml以上,4℃冷藏保存即得到活菌乳饮料。
[0109] 实施例3：利用鼠李糖乳杆菌ZNJ05制造具有预防糖尿病功能的酸奶
[0110] 将原料乳(脱脂奶、鲜奶、复原奶等)经100℃，灭菌10min后冷却至4℃，以3％－5％体积百分比的量加入本发明的鼠李糖乳杆菌ZNJ05，以及加入可共生的制备酸奶的商业发酵剂如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，37℃混菌发酵至滴定酸度为0.6％－0.7％(以乳酸计)，冷藏至4℃并冷藏保存即得到具有预防糖尿病功能的酸奶。
[0111] 实验1、对不同来源的二肽基肽酶-IV利用本发明所述的鼠李糖乳杆菌ZNJ05进行抑制实验，具体结果如图4所示。
[0112] 其中，所用二肽基肽酶-IV的提取方法和测定方法具体如下：
[0113] 1、小鼠肠道提取酶中二肽基肽酶-IV活性的测定
[0114] 取酶标板，25μL 1.5mM Gly-Pro-pNA，25μL CFS(用0.1M pH 6.8PBS做空白对照)，恒温金属浴37℃培养10min，加入二肽基肽酶-IV 50μL(小鼠肠道)，37℃反应60min，加入100μL 1M的醋酸钠缓冲液终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值。重复3次。
[0115] 结果表明，小鼠肠道酶与底物有颜色反应，说明其中含有二肽基肽酶-IV。
[0116] 底物 酶/PBS 吸光值Gly-Pro-pNA PBS 0.1486±0.0026
Gly-Pro-pNA 小鼠肠道提取酶 0.2066±0.0164
[0117] 小鼠肠道中酶的提取
[0118] 清洁级雄性Balb/c小鼠，禁食12h后断头处死，取小肠上段30cm，用无菌的4℃PBS冲洗小肠后，剪碎，置于玻璃匀浆器中。加入约4倍体积的PBS在冰浴下进行研磨、匀浆，倒至离心管。4℃，4000r/min，离心20min，取其上清进行分装，-20℃储存。
[0119] 2、Caco-2细胞中酶的提取
[0120] 将培养至21d的Caco-2细胞的培养板置于冰上，细胞用PBS清洗2次，加入lysis缓冲液(100KIU/mL aprotinin和Triton X-100的PBS溶液)培养5min，将细胞轻轻吹打并移入离心管中进行离心2次：第一次4℃，1000g离心10min，去除细胞残留物；第二次4℃，20000g离心30min，取上清并保存于-80℃。
[0121] Caco-2细胞中提取酶的蛋白含量的测定
[0122] 根据BCA试剂盒的说明书测得Caco-2细胞中提取酶的蛋白含量为1.256mg/mL。
[0123] Caco-2细胞提取酶中二肽基肽酶-IV活性的测定
[0124] 取酶标板，25μL 1.5mM Gly-Pro-p-nitroanilide，25μL CFS(用0.1M pH 6.8PBS做空白对照)，恒温金属浴37℃培养10min，加入二肽基肽酶-IV 50μL(Caco-2细胞)，37℃反应60min，加入100μL 1M的醋酸钠缓冲液终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值。重复3次。
[0125] 结果表明，Caco-2细胞中提取酶与底物有颜色反应，说明其中含有二肽基肽酶-IV。
[0126]底物 酶/PBS 吸光值
Gly-Pro-pNA PBS 0.1336±0.0388
Gly-Pro-pNA Caco-2细胞提取酶 0.7566±0.1902
[0127] 3、猪小肠提取酶中二肽基肽酶-IV活性的测定
[0128] 取酶标板，25μL 1.5mM Gly-Pro-pNA，25μL CFS(用0.1M pH 6.8PBS做空白对照)，恒温金属浴37℃培养10min，加入二肽基肽酶-IV 50μL(猪小肠)，37℃反应60min，加入100μL 1M的醋酸钠缓冲液终止反应，用酶标仪在405nm测样品的吸光值。重复3次。
[0129] 结果表明，猪小肠提取酶在稀释30倍后与底物有颜色反应，说明其中含有二肽基肽酶-IV。
[0130]底物 酶/PBS 吸光值
Gly-Pro-pNA PBS 0.0920±0.0131
Gly-Pro-pNA 猪小肠提取酶 0.4753±0.0091
[0131] 实验2、动物实验：
[0132] 体内预防糖尿病试验采用高脂饲料喂养加注射链脲霉素(STZ)造成的2型糖尿病模型。
[0133] Balb/c小鼠，雄性，周龄4-5周，购自北京维通利华有限公司，合格证号：SCXK(京)2013－0001。饲养于中国医学科学院药用植物研究所SPF级动物房,许可证号：SYXK(京)
2013-0023，室温22±2℃，相对湿度60％RH。定时12小时光照和12小时黑暗，自由饮水取食，并定期更换垫料，定时清洗鼠笼。
[0134] 40只按体重随机分为4组：正常组、模型组、阳性药物组及益生菌饲喂组(除正常组，均饲以高脂饲料，每组10只)。
[0135] 预防性灌胃给药两周后造模，提前一天禁食不禁水12小时，腹腔注射100mg/kg链脲霉素(STZ，SIGMA),隔3天重复注射一次。正常组饲喂基础饲料(粗蛋白含量19.2％，粗脂肪含量4.6％，粗纤维4.0％，粗灰分6.3％，水分8.8％，无氮提取物55.9％)；模型组和阳性药物组(磷酸西格列汀片(捷诺维))试验组以高脂饲料饲喂(粗蛋白含量17.5％，粗脂肪含量17.9％，粗纤维3.1％，粗灰分4.5％，水分8.5％，无氮提取物48.5％)；试验组每天灌胃乳酸菌1×1010CFU/鼠。在给STZ诱导造模后一周，各组小鼠禁食不禁水12h，以血糖仪测定尾静脉血糖值，为空腹血糖值。模型组空腹血糖值为11.3mmoL/L，正常组血糖值为3.7mmoL/L。模型组的血糖组超过正常组血糖值的50％以上，即为二型糖尿病造模成功。
[0136] 造模成功后，阳性药物组每天灌胃10mg/kg，益生菌组每天灌胃250μL益生菌样直至13周实验结束。空腹取血，测定空腹血糖值(图5)及糖基化血红蛋白值(图6)。13周后，模型组空腹血糖值为12.74mmoL/L，阳性药物组空腹血糖值为8.084mmoL/L，益生菌组空腹血糖值为6.74mmoL/L。相比于模型组，益生菌ZNJ05组的小鼠空腹血糖值下降，具有显著性差异(P小于0.05)；同时与正常组的小鼠空腹血糖值相比，益生菌ZNJ05组的空腹血糖高于正常组的小鼠空腹血糖值，但无显著性差异；与阳性药物组(磷酸西格列汀片(捷诺维))的空腹血糖值相比，益生菌ZNJ05组降血糖效果也没有显著性差异。表明益生菌ZNJ05的调节血糖效果与阳性药物的效果无显著性差异，具有显著降低血糖效果。
[0137] 本实验还进一步考察了对糖基化血红蛋白的影响。糖基化血红蛋白是糖尿病评价指标中的金指标，被用来评价长期血糖调节的治疗效果。结果表明：相比于模型组，ZNJ05益生菌组的糖基化血红蛋白值有降低，但无显著性差异；同时，与阳性药物组糖基化血红蛋白相比，也无显著性差异，表明益生菌ZNJ05对糖基化血红蛋白的调节能力介于阳性药物与对照组之间。(P小于0.05)，与阳性药物组的糖基化血红蛋白无显著性差异。表明益生菌对二型糖尿病具有一定的降血糖作用。
[0138] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
