[0043] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。为了方便理解本发明，以下实施例中使用的线虫来源如下，但本发明方法不受线虫来源的限制，本领域技术人员可以采用其他来源的所属种类线虫实现本发明的目的：
[0044] 爪哇根结线虫、 花生根结线虫、象耳豆根结线虫、北方根结线虫、拟禾本科根结线虫、禾本科根结线虫、肾形肾状线虫、矮化线虫、咖啡短体线虫、相似穿孔线虫、水稻潜根线虫、腐烂茎线虫、滑刃线虫和真滑刃线虫 ：自行采集，参考文献： Hu M, X., Zhuo, K. , Liao, J, L. Multiplex PCR for the simultaneous identification and detection of Meloidogyne incognita, M. enterolobii and M. javanica using DNA extracted directly from individual galls. Phytopathology, 2011, 101(11): 1270-1277 。
[0045] 螺旋线虫： 自行采集，参考文献：陈英 . 广州市经济作物线虫的调查与鉴定 . 华南农业大学（硕士论文）， 2008 ， pp84。
[0046] 以下生物材料为发明人获赠得到：
[0047] 秀丽小杆线虫： Dr. Zhang Lianhui ( Institute of Molecular and Cell Biology, 61 Biopolis Drive, Singapore) 赠送；
[0048] 纳西根结线虫： Dr. Ye Weimin ( Nematode Assay Section, Agronomic Division, North Carolina Department of Agriculture & Consumer Services, USA) 赠送。
[0049] 实施例1
[0050] （1）引物设计与合成
[0051] 根据植物线虫大亚基核糖体DNA（GenBank 登录号：JF461074-JF461078，AF435797-AF435800，EU364889，AF435803，AF435794，GQ130139，DQ145641，DQ328685，HQ420904，HQ420905，AF435793，AF435801，DQ328713，GU120091，HM131853- HM131884）的D2D3区序列特征设计。所述引物的核苷酸序列为：
[0052] NF3：5’- GTGAGGGAAAGTTGCAAAGCACT -3’；
[0053] NR0：5’- GTTCACCATCTTTCGGGTCTCAC -3’；
[0054] MF0：5’- GGGGATGTTTGAGGCAGATTTG -3’；
[0055] RF4：5’- GGTCTGGCTCCCATGTTTTCCA -3’；
[0056] D2A：5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3'；
[0057] D3B：5'-TGCGAAGGAACCAGCTACTA-3'。
[0058] 引物的特异性检测：先进行BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)网上比对，发现引物对NF3/NR0和根结线虫、肾形肾状线虫等植物寄生线虫以及自由生活的小杆线虫都有100%的相似性。根结线虫特异引物MF0和根结线虫属内象耳豆根结线虫M. enterolobii（JN005866、JN005864）、南方根结线虫M. incognita（JN005858-JN005861、AF435794）、爪哇根结线虫M. javanica（JN005852、JN005854、JN005856、JN005857）、花生根结线虫M. arenaria（JN005870、EU364889、AF435803、U42339、U42342），伪根结线虫M. fallax（FN429017），西班牙根结线虫M. hispanica（GQ375158、EU443606-EU443608），泰国根结线虫M. thailandica（EU364890），朝鲜根结线虫M. konaensis（AF435797）以及巴拉那咖啡根结线虫M. paranaensis（AF43579-AF435780）有100%的覆盖率和100%的相似性；肾形肾状线虫的特异引物RF4只和肾形肾状线虫（HM131853 HM131884、GU120091、DQ328713）有100%的覆盖率和100%的相似性。
[0059] 首先采用线虫的通用引物D2A和D3B对单条线虫的DNA提取物进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR产物为模板，分别采用线虫通用引物NF3和根结线虫的特异引物MF0以及肾形肾状线虫的特异引物RF4与下游通用引物NR0进行PCR扩增以检测引物的特异性。
[0060] PCR反应体系为：上下游引物各0.2μM，0.2mM dNTPs，含2 mM MgCl2的1×PCR缓冲液，1U Taq DNA聚合酶，1µL第一轮PCR产物和余量ddH2O，共25 μL。
[0061] PCR条件为：预变性94℃ 3min；94℃ 变性30 s，59℃退火30 s和72℃延伸 30s，共30个循环；终延伸72℃ 10min。
[0062] 将5µL PCR产物用2％琼脂糖电泳分离，结果表明引物对NF3/NR0扩增根结线虫不同种、肾状线虫不同种群、其他植物寄生线虫以及自由生活的小杆线虫均产生约600bp左右的条带；引物对MF0/NR0扩增南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、象耳豆根结线虫的不同种群均可得到424bp大小的条带，扩增北方根结线虫得到427bp大小的条带，扩增拟禾本科根结线虫（M. graminicola）和禾本科根结线虫（M. graminis）均得到431bp大小的条带，而用作对照的其他植物寄生线虫和秀丽小杆线虫（C. elegans）均没有条带产生。引物对RF4/NR0只可扩增肾形肾状线虫不同种群得到265bp大小的条带，而包括根结线虫在内的其他植物寄生线虫以及秀丽小杆线虫均没有条带产生。此结果说明所设计引物具有高度特异性。
[0063] （2）多重PCR扩增反应体系的建立
[0064] 采用线虫通用引物NF3和根结线虫的特异引物MF0以及肾形肾状线虫的特异引物RF4与下游通用引物NR0进行巢式多重PCR扩增以检测象耳豆根结线虫。DNA模板来自单条线虫。按下列体系配置PCR反应体系：
[0065] 10×PCR buffer 2.5 µL，2.5mmol/L dNTPs 2 µL，10μmol/L NF3 0.3µL，10μmol/L NR0 1µL，10μmol/L MF0 0.7µL，10μmol/L RF4 0.5µL，rTaq 0.25µL，第一轮PCR产物1.0 µL和余量的ddH2O，共 25.0µL。
[0066] 多重PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃后延伸5 min。PCR反应可在Bio-Rad PCR 仪上完成。然后用2.0%琼脂糖凝胶加样5µL PCR产物电泳，紫外灯下观察，用凝胶成像分析系统照像。
[0067] 电泳结果见附图1所示，其中1为南方根结线虫，2为爪哇根结线虫，3为花生根结线虫不同种群，4为象耳豆根结线虫不同种群，5为纳西根结线虫，6为北方根结线虫种群，7为拟禾本科根结线虫，8为禾本科根结线虫，9～13为肾形肾状线虫不同种群，14为南方根结线虫和肾形肾状线虫的混合DNA，15～23分别为矮化线虫、螺旋线虫、咖啡短体线虫、相似穿孔线虫、水稻潜根线虫、腐烂茎线虫、滑刃线虫、真滑刃线虫和秀丽小杆线虫，24为清水对照。结果表明该多重PCR体系特异性好。
[0068] （3）土壤总DNA的提取方法
[0069] 取1g灭菌土（基质：壤土：沙=1:1:1，质量比；购自大洋植树袋厂有限公司），分别加入1条根结线虫或/和1条肾形肾状线虫。同时以不加虫的灭菌土DNA作为阴性对照，以ddH2O作为空白对照。利用以下4种不同方法进行DNA提取，每个处理4个重复。
[0070] 方法I：本实验自制抽提缓冲液Buffer H，使用酚氯仿进行土壤DNA提取。具体步骤如下：
[0071] 1） 称取1g灭菌土于2mL离心管，加入600μL预热的抽提缓冲液Buffer H [20mM EDTA，1.5M NaCl，500mM Tris（pH 8.0），10% SDS，1% PVP]，颠倒混匀；
[0072] 2）加入5μL（20mg/mL）蛋白酶K，涡旋混匀，置于65℃水浴1h，期间不时摇匀；
[0073] 3）取出，在Mobio Vortex上以最大速度水平震荡10min；
[0074] 4）12000g室温离心5min，取上清，加入300μL Tris-饱和苯酚，颠倒混匀，4℃12,000g离心10min；
[0075] 5）将上清转入干净的1.5 mL离心管中，加入300μL 氯仿/异戊醇（24：1，体积比），颠倒混匀，4℃ 12,000g离心10min；
[0076] 6）将上清转入干净的1.5mL离心管，加入1/10体积的冰NaAc（3 M， pH 5.2）和2倍体积的冷无水乙醇，混匀后–20℃静置20min，4℃ 12,000g离心10min，弃尽上清；
[0077] 7）分别用500μL 70%的乙醇（体积百分比）和无水乙醇各洗沉淀一次，室温晾干；
[0078] 8）加100μL灭菌双蒸水复溶，便可得到粗提的土壤DNA。粗提的DNA可直接用KOD Fx酶PCR扩增或–20℃保存。
[0079] 方 法 II：选 用 土 壤DNA 提 取 试 剂 盒 PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio,Carlsbad, CA），具体操作参考产品说明。
[0080] 方法III：选用土壤DNA提取试剂盒UltraClean Soil DNA Purification Kit（MoBio, Carlsbad, CA），具体操作参考产品说明。
[0081] 方法IV：参考Yan等的方法（Yan G, Smiley R W et al. Detection and Discrimination of Pratylenchus neglectus and P. thornei in DNA Extracts from Soil. Plant Disease. 2008, 92(11): 1480-1487），使用抽提缓冲液Buffer D进行土壤DNA的粗提。
[0082] 对不同方法提取的土壤DNA进行多重PCR扩增检测DNA提取效率。除PCR循环数为35个循环外，其余反应体系和反应条件同前“（2）多重PCR扩增反应体系的建立”所述。采用通用引物NF3/NR0以及根结线虫的特异性引物MF0和肾状线虫的特异引物RF4对分别加入了1条根结线虫和/或1条肾形肾状线虫的土壤DNA进行多重PCR扩增。同时未加虫的灭菌土DNA作为对照，并设一清水阴性对照。扩增结果表明：使用两种Mobio试剂盒提取的DNA和用自制DNA提取缓冲液Buffer H提取的DNA巢式扩增均有特异性扩增条带产生，而Buffer D提取的土壤DNA粗提物扩增不到目的条带。电泳结果见附图2。附图中，I为裂解液Buffer H提取的DNA粗提物，II为土壤强力试剂盒（MOBIO）提取的DNA，III为普通土壤提取试剂盒（MOBIO）提取的DNA，IV为裂解液Buffer D提取的DNA粗提物；1代表1g灭菌土中加入1条南方根结线虫；2代表1g灭菌土中加入1条肾形肾状线虫；3代表1g灭菌土中加入1条南方根结线虫和1条肾形肾状线虫，4为灭菌土不加虫阴性对照，5为根结线虫和肾形肾状线虫单条虫的DNA混合物阳性对照，6为清水对照。因为试剂盒价格昂贵，因此本结果认为使用自制Buffer H作为裂解液对土壤总进行提取即可满足土壤中植物寄生线虫快速检测的需要。
[0083] （4）不同土壤DNA粗提物纯化方式比较
[0084] 为了提高检测的灵敏度，本试验设置1g至30g不同重量灭菌土（基质：壤土：沙=1:1:1）中加入1条根结线虫和1条肾形肾状线虫。同时以不加虫的灭菌土DNA作为阴性对照，以ddH2O作为空白对照。利用自制抽提缓冲液Buffer H进行 DNA提取，每个处理4个重复。DNA粗提物使用三种不同方法进行纯化，一是使用PowerClean® DNA Clean-Up Kit（MoBio, Carlsbad, CA），二是使用北京天根生物公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，三是使用北京天泽基因公司的腐殖酸去除剂。三种纯化方式具体操作见产品说明。纯化产物进行多重PCR扩增以评估检测的灵敏度。反应条件同前述“（3）土壤总DNA的提取方法”所述。结果表明：MoBio公司的纯化试剂盒纯化效果最好，可使多重PCR扩增的检测灵敏度提高到25g灭菌土中含有1条根结线虫和1条肾形肾状线虫；天根公司的普通DNA回收试剂盒次之，可检测到10g灭菌土中的1条根结线虫和1条肾形肾状线虫，灭菌土重量为15g时根结线虫特异条带不清晰；天泽基因公司的腐殖酸去除剂纯化效果最差，但也可检测到5g灭菌土中的1条根结线虫和1条肾形肾状线虫。电泳结果见附图3。附图中，A为PowerClean® DNA Clean-Up Kit纯化结果，B为天根生物公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化结果，C为北京天泽基因公司的腐殖酸去除剂纯化结果；1,2,3,4,5,6,7,8分别为1g，2g，5g，10g，15g，20g，25g，30g灭菌土中加入1条根结线虫和1条肾形肾状线虫的总DNA扩增结果；9为单条根结线虫和肾形肾状线虫的DNA混合物扩增阳性对照；10为灭菌土不加虫阴性对照；11为清水空白对照；M1为DS2000分子量Marker；M2为100bp分子量Marker。
[0085] 实施例2 根结线虫和肾形肾状线虫快速检测方法的田间应用
[0086] 对采自广东、广西、云南、海南、内蒙古等省份不同地区的57份黄瓜根围土壤样品，首先根据形态学观察结合28S D2D3区分子扩增及序列比对确定主要植物寄生线虫种类，然后取5g新鲜的黄瓜根围土壤，采用自制抽提缓冲液Buffer H进行DNA粗提方法，北京天根生物公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，纯化产物直接进行巢式多重PCR，同时以不加虫的灭菌土作为阴性对照。每个样品4个重复。反应条件同前述“（3）土壤总DNA的提取方法”所述。检测结果见附图4，附图4中，1～46为田间黄瓜根围不同土壤样品，47为单条根结线虫和单条肾形肾状线虫DNA扩增结果，48为清水对照。多重PCR结果表明：2、7、10、12、17、20、21、23、26、27、30、32-38泳道的样品产生1条约600bp的通用条带和1条约400bp的根结线虫特异条带，说明这些样品中含有根结线虫；1、5、6、8、9、11、16、18、
25、28、31、39、40、43泳道产生1条约600bp的通用条带和1条约250bp的肾形肾状线虫特异条带，其余泳道产生约600bp、400bp和约250bp大小的3条带，说明这些样品中既含有根结线虫，也有肾形肾状线虫存在。多重PCR检测灵敏度分别为500g土壤中含有15条根结线虫或16条肾形肾状线虫。通用条带的产生可以避免假阴性扩增结果的发生，有效防止结果判断错误。通过土壤DNA多重PCR鉴定结果与形态学和28S-PCR结果验证结果一致，充分说明根结线虫和肾形肾状线虫土壤DNA多重PCR检测方法的灵敏度、可信度及准确性。
