猪背膘厚相关SLC13A5基因的分子克隆及应用   0    0

[0001] 本发明属于家畜分子生物学技术领域，涉及一种包含如SEQ ID NO：1所示猪基因核苷酸的核酸分子。本发明还涉及如SEQ ID NO：1所示的SLC13A5基因的分子克隆方法及多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。

[0002] 猪肉是动物性蛋白的主要来源，随着人们生活水平的提高，对肉质的要求也相应提高。影响猪肉质的因素有遗传和非遗传的，猪肌内脂肪含量对肉质性状有很大的影响，一般来说，肌内脂肪含量越高，猪肉质越嫩，从而肉质越好。肉质性状大多属于数量性状，由微效多基因控制。许多肉质性状只能在动物屠宰后才能测定，所以常规选育只能进行同胞或半同胞测定，这样必加大选育成本，且遗传进展缓慢。猪基因组草图的构建，使得寻找影响肉质性状的主基因或与其紧连锁的分子标记成为可能，这些分子标记一经确认，就可进行标记辅助选择育种。利用分子标记进行辅助选择(MAS)进行肉质性状改良是一种有效的途径。

[0003] 动物、植物和酵母SLC13家族(Solute carrier family 13member 5，SLC13A5)包括SLC13A1、SLC13A2、SLC13A3，SLC13A4和SLC13A5五个相关蛋白，SLC13蛋白编码含有8-13个跨膜结构区域的多跨膜蛋白，分布于众多的组织中，且以肾脏和胃肠道上皮细胞中的表达量最多。在质膜的上皮细胞(肾、小肠、胎盘和肝脏)和中枢神经细胞中，哺乳动物SLC13成员介导Na+耦合的阴离子协同运输，其中NAS1(SLC13A1)和NAS2(SLC13A4)负责协同转运蛋白运输硫酸、硒和硫代硫酸钠阴离子，而NaDC1(SLC13A2)、NACT(SLC13A5)和NaDC(SLC13A3)运输双羧酸循环和三羧酸循环中间体，例如：琥珀酸、柠檬酸和α-酮戊二酸。研究发现敲除SLC13A5基因的小鼠的干细胞ATP/ADP比下降，依次激活肝脏AMP激活蛋白激酶(AMPK)信号通道、诱导过氧化酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)、抑制乙酰辅酶A羧化酶-2(ACC-2)以及减少固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c)的含量，从而促进了肝脏线粒体的生物合成作用，最终使得脂质氧化、能量消耗且肝脏脂质的从头合成得到抑制。此外，敲除SLC13A5基因还能有效抑制高脂饲料或年龄导致的小鼠肥胖和胰岛素代谢紊乱且该基因表达量还受营养物质的调控。研究还表明，钠依赖柠檬酸转运蛋白(NaCT)是导致神经元受损的主要原因，且SLC13A5基因CpG位点的DNA甲基化也是肾通透细胞癌CpG岛甲基化表型的标志,神经胶母细胞SLC13A5的CpG位点在启动子甲基化和表达水平之间呈负相关。Elangovan Gopal等研究发现人类HepG2、Huh-7和大鼠MH1C1肝细胞株对柠檬酸吸收均主要取决于Na+，相对柠檬酸循环中间体而言，这些细胞株对柠檬酸盐更具亲和力，值得注意的是Li+对人SLC13A5转运蛋白起激活作用而对大鼠的该蛋白则起抑制作用。

[0004] Hirwa等(2013)利用基因芯片技术，以8周龄的生长速度快的外来品种白洛克鸡和生长速度慢的中国地方品种杏花鸡两个鸡种为实验材料，结果发现该基因在杏花鸡的下丘脑中下调表达。

[0005] Luo等(2012)以大白猪和东北民猪构建F2代资源家系，F2代有455头猪，所用基因芯片为PorcineSNP60K，测量了背最长肌的肌内脂肪含量、大理石纹、肉色等指标，全基因组关联分析(GWAS)研究表明，SLC13A5基因与猪的肌内脂肪含量显著相关。

[0006] 目前国内外对猪SLC13A5基因在不同猪种和不同组织之间表达量差异性的研究未见报道，与该基因相关报道甚少，本发明首次利用RACE(Rapid Amplification cDNA Ends)技术克隆猪SLC13A5基因cDNA全长，并筛选了该基因的SNP，并用PCR-RFLP技术进行了分型，并分析了该基因与猪校正背膘厚及达100kg日龄的相关关系。

[0007] 本发明的目的在于克隆猪SLC13A5基因cDNA分子，寻找SLC13A5基因的单核苷酸位点以及基因多态性的检测方法，为猪肉质性状标记辅助育种提供一种有用的分子标记。

[0008] 本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种克隆和检测猪SLC13A5基因的分子标记及其应用，为猪肉质性状标记辅助选择提供有用的分子标记。

[0009] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：以人的SLC13A5基因序列(GenBank收录号为NM_001284509.1)为种子序列，在GenBank中利用BLASTN(Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide)，参照其同源性在80％以上的猪EST(Expression Sequence Tags)设计特异引物，利用RACE(Rapid Amplification of cDNA End)，克隆出猪SLC13A5基因cDNA全长，该猪SLC13A5基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。SLC13A5基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的SLC13A5基因序列设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序筛选SNP，并利用PCR-RFLP进行基因分型技术，发现第251bp处有一个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-Bsu36I多态性，并利用该标记检测了中外猪种的情况。

[0010] 试验材料：25日龄沙子岭猪由湖南省湘潭市沙子岭猪资源场提供，取背最长肌-80℃保存，5′-RACE Version 2.0试剂盒购于Invitrogen公司，3′-RACE SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒购于Clontech公司。

[0011] 总RNA提取与cDNA第1链的合成：用SUPERSCRIPT II RT酶和特异性引物GSP-1对总RNA进行基因第一链cDNA的合成，使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理，最后对cDNA进行纯化。

[0012] 引物设计：据GenBank人SLC13A5基因(登录号NM_001284509.1)序列保守区设计引物，引物设计的软件为Primer Premier 5.0，引物设计的原则是特异性引物长度在23-28个核苷酸，GC含量在50％-70％，退火温度在65-70℃，使用巢式PCR进行扩增。

[0013] 编码序列PCR扩增：以合成的猪cDNA为模板，在保守区设计引物经过克隆测序，获得该基因部分CDS(coding domain sequence)序列。

[0014] 5′-RACE扩增：使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA末端加上多聚C，使用引物GSP5(Gene-Specific Primers)和试剂盒中的桥连铆钉引物AUAP(表1)对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增；使用引物GSP-3和试剂盒里中的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增，将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，纯化后的PCR产物与pMD18-T进行连接，转化后对阳性克隆进行测序，获得557bp的目的序列。

[0015] 3′-RACE扩增：使用合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，然后用引物GSP3和UPM(Universal Primer A Mix)(表1)进行第二轮PCR扩增。将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化。纯化后的PCR产物与pMD18-T进行连接，转化后挑取阳性克隆测序。

[0016] 将扩增得到的5′-RACE长度为557bp、3′-RACE扩增得到的长度1320bp和开放阅读框长度为1665的编码序列的序列拼接得SLC13A5基因的全长cDNA序列，并提交GenBank，收录号为KF318030，并以此序列运用Primer Premier 5.0设计引物，筛选该基因第12外显子的SNP标记，并且PCR-RFLP进行标记的分型，从而完成本发明的有关内容。

[0017] 表1 本发明中使用的引物序列

[0018]

[0019] 以下为SLC13A5基因分子标记的筛选。

[0020] DNA样品：取小块猪耳组织提取DNA，共4个品种，其中大白猪330头，桃源黑猪112头、沙子岭猪57头、宁乡猪65头和大围子猪80头，共计644头。

[0021] 引物设计：利用比较基因组学方法根据猪的SLC13A5基因(GenBank收录号为KF318030)的第12外显子，以该基因在GenBank作BLAST，序列比对后筛选出候选SNPs位点，参考GenBank序列序列设计引物，运用PCR-RFLP技术验证该位点。

[0022] 制备了检测上述序列表SEQ ID NO：1基因片段突变的引物对，所述引物对，正向引物为5′-CTCATTCCTGCGTCTTATTC-3′；反向引物为5′-GCTGTGGGTGGTGTCATT-3′。

[0023] PCR条件：PCR反应体系(总体积20μL)：10×Buffer 2μL，2mmol/L dNTPs 1.6μL，20mmol/L MgCl21.6μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，DNA模板(100ng/μL)1μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.4μL，dd H2O 12.6μL。

[0024] 反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，共35个循环；72℃后延伸8min，最后4℃保存。

[0025] 取10μL PCR扩增产物，加2μL溴酚蓝上样缓冲液混匀后，点样于1％的琼脂糖凝胶(含0.05％EB)上，然后点6μL 100bp DNA Markers作为参照。5V/cm电泳0.5-1.0h。电泳结束后在凝胶成像系统中观察扩增结果并拍照，结果如图1所示。将纯化后的PCR产物后送铂尚生物技术公司测序。

[0026] PCR产物的Bsu 36I酶切。

[0027] 在10μL PCR产物中加入0.8μL 10×内切酶缓冲液、0.2μL限制性内切酶和1μL双蒸水，总体积为12μL，37℃消化4-10h。A/G位点用2％琼脂糖凝胶电泳分析，5V/cm电压电泳0.5h，紫外灯下观察结果并拍照，对扩增产物进行测序，序列如SEQ ID NO：1所示，扩增片断为第12外显子，共815bp，为PCR-RFLP-Bsu 36I分子标记，图1是本发明中SLC13A5基因PCR-RFLP的3种基因型的TT、TC和CC电泳结果。图中M：DNA分子量标准(100bp DNA Ladder Marker)。

[0028] SNP发现与检测方法建立：申请人设计了扩增包含该SNP引物，经分析A/G位点的突变可以采用Bsu 36I进行酶切检测多态性。在扩增的251bp的片断上，经过测序确认，只存在一个SNP，该SNP为A/G突变，该SNP可用PCR-RFLP-Bsu 36I进行分型，电泳检测结果显示在SLC13A5基因的A/G位点存在3种基因型，即AA基因型(815bp)、AG型(251bp、564bp、815bp)和GG型(251bp、564bp)。

[0029] 利用上述制备的猪分子标记应用于外来猪种和中国地方品种的基因频率与基因型频率分析，并分析了该标记与校正背膘厚和达100kg日龄的相关关系，从而完成了本发明。

[0030] 本发明将为标记辅助选择(MAS)奠定坚实的基础，为提高养猪生产经济效益，并指导猪的育种实践提供理论依据。

[0033] 下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施并不对本发明做任何限定。

[0034] 以人的SLC13A5基因序列(GenBank收录号为NM_001284509.1)为种子序列，在GenBank中利用BLASTN，参照其同源性在80％以上的猪EST(Expressed Sequence Tags)设计特异引物，利用RACE技术克隆出猪SLC13A5基因cDNA全长，SLC13A5基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的SLC13A5基因序列设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序筛选SNP，发现第251bp处有一个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-BSu 36I多态性，并利用该检测了该标记在中外猪种的分布情况。

[0035] 取25日龄沙子岭猪背最长肌，总RNA提取与cDNA第1链的合成使用SUPERSCRIPT II RT酶和特异性引物GSP-1对总RNA进行基因第一链cDNA的合成，使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理。

[0036] 利用RACE试剂盒进行5′-RACE和3′-RACE扩增，将5′-RACE和3′-RACE拼接得SLC13A5基因的全长cDNA序列，从而完成本发明的SLC13A5基因的克隆。

[0037] 引物设计：利用比较基因组学方法根据人位于第12号染色体的SLC13A5基因(GenBank收录号为NM_001284509.1)，以该基因在GenBank作BLAST，序列比对后筛选出SLC13A5基因候选SNPs位点，选取SLC13A5基因候选SNPs位点，参考GenBank序列NM_001284509.1序列设计引物，运用PCR-RFLP技术验证该位点。正向引物为5′-CTC ATT CCT GCG TCT TAT TC-3′，反向引物为5′-GCT GTG GG TGG TGT CAT T-3′。

[0038] PCR反应条件：PCR反应体系(总体积20μL)，包括10×Buffer 2μL，2mmol/L dNTPs1.6μL，20mmol/L MgCl21.6μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，DNA模板(100ng/μL)1μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.4μL，dd H2O 12.6μL。

[0039] PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，共35个循环；72℃后延伸8min，最后4℃保存。

[0040] 取10μL PCR扩增产物，加2μL溴酚蓝上样缓冲液混匀后，点样于2％的琼脂糖凝胶(含0.05％EB)上，点6μL 100bp DNA Markers作为参照。5V/cm电泳0.5-1.0h。

[0041] PCR产物的Bsu36I酶切：在10μL PCR产物中加入0.8μL 10×内切酶缓冲液、0.2μL限制性内切酶和1μL双蒸水，总体积为12μL，37℃消化4-10h。用2％琼脂糖凝胶电泳分析，5V/cm电压电泳0.5h，紫外灯下观察结果并拍照。

[0042] PCR-RFLP技术应用于SLC13A5基因的Bsu 36I多态性的检测。

[0043] 本发明以SLC13A5基因为研究对象，以4个地方猪种(大围子猪、沙子岭猪、宁乡猪、桃源黑猪)、1个外来猪种(大白猪)，其中大白猪330头，大围子猪80头、沙子岭猪57头、宁乡猪65头和桃源黑猪112头，共644头。

[0044] 发明人设计了扩增包含该SNP引物，A/G位点突变采用Bsu36I进行酶切检测多态性。在扩增的251bp的片段上，存在1个Bsu36I的酶切位点，电泳检测结果显示在SLC13A5基因的A/G位点存在3种基因型，AA基因型(815bp)、AG型(251bp、564bp、815bp)和GG型(251bp、564bp)。

[0045] 对SLC13A5基因A/G位点的基因频率、基因型频率进行检测，并分析其遗传多态性。

[0046] PCR-RFLP-Bsu 36I多态性在各品种中的分布情况如表2所示，由表2可知，在沙子岭猪、宁乡猪和大围子猪这3个湖南地方品种中，G基因为优势等位基因，宁乡猪、沙子岭猪和大围子猪基因频率分别为0.8769、0.7018、0.5750，而在桃源猪中，A基因频率为优势等位基因，其基因频率为0.7991。在外来品种大白猪中A基因为优势等位基因，基因频率为0.7061；根据适合性卡方检验，大围子猪差异不显著。

[0047] 表2 不同品种SLC13A5基因A/G位点的基因频率和基因型频率分布

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[0049] 表3 SLC13A5基因251bp处A→G变异位点的基因遗传多态性分析

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[0051] 由表3可知，5个猪种的遗传纯合度都在0.5以上，外来猪种遗传纯合度介于湖南本地猪种之间(0.5113-0.7841)。大白猪遗传杂合度介于湖南本地猪(桃源黑猪和沙子岭猪)之间。除宁乡猪和桃源猪外，其余3品种本地猪的有效等位基因数均高于外来大白猪猪种。从多态信息含量上看，除宁乡猪外，其余4品种猪的PIC在0.25-0.5之间，属于中度多态，说明该基因位点，大白猪、大围子猪、沙子岭猪和桃源黑猪具有遗传多态性，并且具有较高的遗传变异，而宁乡猪低于0.25，结果表现为低度多态。

[0052] 猪SLC13A5基因PCR-RFLP-Bsu 36I分子标记校正背膘厚选择中的应用。

[0053] 为了将该标记应用于校正背膘厚的选择，利用本项发明的分子标记检测了277头大白猪的校正背膘厚和达100kg校正日龄，应用一般线性模型(General Linear Model,GLM)，估算了AA型、AG型和GG型3种基因型的最小二乘均数，其结果见表4，由表4可知，AA、AG和GG基因型在校正日龄和校正背膘厚差异显著(p<0.05)，即基因型AA型可降低背膘厚。此标记可应用于猪校正背膘厚的标记辅助选择(Marker Assistant Selection，MAS)。

[0054] 表4 SLC13A5-251A→G位点不同基因型对大白猪生长性状的效应

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[0056] 注：表中括号内为该基因型个体数。

[0031] 图1是本发明的SLC13A5基因A/G位点的Bsu36I酶切电泳结果。

[0032] 图中：泳道4,5,6,10,11,12：AA基因型；泳道1,2,7,8,9：AG基因型：泳道3：GG基因型；M:100bp DNA Ladder Marker