[0013] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0014] 实施例1
[0015] 供试材料
[0016] 本实施例的水稻材料为：以湖南农业大学水稻基因组学实验室所提供的TY和高感病品种CO39及其两者杂交的F2群体为试验材料。
[0017] 本实施例的稻瘟病菌菌株：318-2，由湖南农业大学水稻基因组学实验室保存提供。
[0018] 育苗
[0019] 试验于4月20日播种，将TY、CO39和TY/CO39F2群体种子于37℃浸种(两干两湿)，露白后间隔播种于育秧盘中，温室育苗，育苗土为购买的营养土。当幼苗在接种前一周(二叶期)时，施少量氮肥(2g/盘)。
[0020] 稻瘟病菌菌株的培养
[0021] 菌丝体生长：将已纯化的稻瘟病菌株分别接种于燕麦-西红柿平板培养基(燕麦-西红柿培养基的配制方法：称取燕麦片30g，放入搅拌机中，加600mL蒸馏水，将其搅碎，纱布过滤去掉残渣，再加入200mL西红柿汁，最后加入琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，分装到3个三角烧瓶中，灭菌后倒成平板培养基备用)上培养，将接种后的平板培养基放入26℃恒温箱中，黑暗培养7～10天，至菌丝覆盖整个平板培养基时，加入3～5mL的灭菌水，用棉签将菌丝轻轻刮掉，使其从营养生长变成生殖生长。
[0022] 稻瘟病孢子培养：将菌丝刮掉后的平板培养基放置在智能光照培养箱中，24h光照培养，温度控制在26～28℃，4～7天之后等到产孢充分，每个平板培养基用20mL含有0.02％Tween20的无菌水洗下孢子，过滤到盛有灭菌水的烧杯中，经搅拌制成接种悬浮液，其浓度为每毫升20～30万个孢子。用血小球计数板观察稻瘟病菌孢子的数量，接种浓度为在100倍显微镜下，平均每个视野的孢子数量20～30个孢子。
[0023] 稻瘟病菌株的接种
[0024] 当幼苗生长至三叶一心时，将育秧盘放入塑料保湿箱中，然后将保湿箱移至专用接种室内进行接种，接种室内设有空调、加湿器、植物生长灯等设备以保证室内有适宜的温度(26～28℃)和湿度(80～95％)。用喷雾器将适宜浓度的接种悬浮液，以气雾的形式均匀喷洒在秧苗上，使每个叶片都布满均匀的雾点。接种完后，将保湿箱放置在专用接种室内，黑暗保湿24h(秧苗以26～28℃和保持叶片上有水珠的湿度条件为佳)，而后移出室外，正常光照周期进行培养，并注意保温、保湿，确保病斑的正常扩展。
[0025] 稻瘟病抗性调查
[0026] 一般接种7天后即可进行病情鉴定，或当感病对照品种达到高度发病时调查。以国际水稻所0～9级评判标准为依据，逐株鉴定和记载，分级标准：0级，无病斑；1级，仅有小的针尖大小的褐点；2级，较大褐点；3级，直径1～2mm圆形稍大灰色病斑，边缘褐色；4级，1～2mm灰色纺锤形病斑，通常局限于2条叶脉之间；5级，灰色梭形病斑，受害面积为叶面积的
4％～10％；6级，灰色梭形病斑，受害面积为叶面积的11％～25％；7级，灰色梭形病斑，受害面积为叶面积的26％～50％；8级，灰色梭形病斑，受害面积为叶面积的51％～75％；9级，灰色梭形病斑，受害面积大于叶面积的75％或叶片全部枯死。统计分析时，0～3级为抗病类型(R)，4～9级为感病类型(S)。通过抗性调查，总共获得极端感病群体1019株。
[0027] 稻瘟病抗性基因Pi2-1的精细定位
[0028] 为了精细定位稻瘟病抗性基因Pi2-1，将初步定位目的区间的9311和NPB基因组序列进行Alignment比对，重新设计了7对分子标记，其中，分子标记WY6-3、WY6-5、WY6-8和T6在TY和高感品种CO39两个亲本之间存在多态性(表1)。分别利用这4对多态标记和初步定位采用的5对多态标记【天津野生稻稻瘟病抗性的遗传分析与抗瘟基因Pi2-1的初步定位，王悦等，2013，39(1)，湖南农业大学学报(自然科学版)】，对1019个感病单株进行基因型分析，最终将Pi2-1基因定位在WY6-8和T6之间，前者有2个重组子，后者发现1个重组子，两个标记之间的遗传距离为0.2cM(图1)。
[0029] 表1水稻稻瘟病抗性基因Pi2-1位点引物信息
[0030]
[0031] 实施例2
[0032] 供试材料
[0033] 本实施例的供试材料为：TY与水稻恢复系品种R006回交构建近等基因系，获得BC1F1，BC1F1套袋自交获得BC1F2。
[0034] 供试的TY、R006和46个TY/R006BC1F2株系的种子，预先在37℃浸种(两干两湿)，露白后，播种于塑料育秧盘中。育苗土采用市面上购买的营养土，温室育苗。当幼苗在三叶一心时，两亲本及BC1F2各株系分别取1g的嫩叶，采用CTAB方法提取基因组DNA。
[0035] 用上述与稻瘟病抗性基因Pi2-1紧密连锁的分子标记WY6-8(正向引物：5，-TCGAAAATTGGTGAGGAGGA-3，，反向引物：5，-GTGCCCGACGCATGATGACT-3，)和T6(正向引物：5，-GATCGGTCACGCATAGAGG-3，，反向引物：5，-CCACCCATCCCAACAACAC-3，)扩增两个亲本和46个BC1F2株系的基因组DNA检测BC1F2各株系的稻瘟病抗性。
[0036] PCR反应体系为：PCR扩增总体积为10μL，其中，DNA模板(20ng/μL)1μL，引物(2pmol/μL)1μL，10×Buffer 1μL，10mM dNTPs(2.5mM)0.2μL，rTaq(5U/μL)0.1μL，ddH2O 6.7μL。
[0037] PCR扩增程序：95℃预变性5min；接下来35个循环：95℃变性30s，55～58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃再延伸7min，4℃保存。
[0038] 结果表明：与稻瘟病抗性基因Pi2-1紧密连锁的分子标记WY6-8(正向引物：5，-TCGAAAATTGGTGAGGAGGA-3，，反向引物：5，-GTGCCCGACGCATGATGACT-3，)和T6(正向引物：5，-GATCGGTCACGCATAGAGG-3，，反向引物：5，-CCACCCATCCCAACAACAC-3，)在9、13、17、25、39等5个BC1F2株系中均能用电泳检测到与水稻品种TY相同的带型，即含有稻瘟病抗性基因Pi2-1，是水稻抗稻瘟病株系。
[0039] 实施例3
[0040] 将上述实施例2中的TY和R006两个亲本和46个TY/R006BC1F2株系分别种植于湖南农业大学水稻基因组学实验室和湖南省国家稻瘟病抗性鉴定中心(桃江)，分别进行室内稻瘟病人工接种抗性鉴定和田间自然诱发抗性鉴定。
[0041] 人工接种抗性鉴定方法参照【天津野生稻稻瘟病抗性的遗传分析与抗瘟基因Pi2-1的初步定位，王悦等，2013，39(1)，湖南农业大学学报(自然科学版)】，田间自然诱发抗性鉴定方法参照【湘资3150微效抗瘟性基因鉴定，黄红梅等，2011，41(5)，植物病理学报】[0042] 利用与稻瘟病抗性基因Pi2-1紧密连锁的分子标记WY6-8和T6检测抗稻瘟病育种群体的方法与室内人工接种鉴定和田间自然诱发鉴定的结果一致，说明本发明利用稻瘟病抗性基因Pi2-1的分子标记方法准确性高。
[0043] 表2利用分子标记改良水稻恢复系R006稻瘟病抗性鉴定结果
[0044]
[0045] A：基因型与TY相同的带型；B：基因型与R006相同的带型；H：TY/R006的杂合子带型。
[0046] 本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
[0047] 最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
