[0004] 本发明针对之前三维SMS荧光显微技术在进行深度方向扫描时，存在的荧光蛋白分子被漂白等问题，提出了一种新型的抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统。该系统利用时域聚焦特性，不漂白非聚焦平面的荧光蛋白分子，结构简单，并且通用性好、也可用于二维成像。
[0005] 一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统，包括第一激光器、扩束准直单元、相位光栅、第三透镜、第一二色镜、物镜、可正对物镜往复移动的样品台、滤光片、第四透镜、探测器、第二二色镜、第二激光器；
[0006] 所述第一激光器出射的激光经过扩束准直单元扩束准直后，倾斜入射到相位光栅表面，并被相位光栅反射后照射至第二二色镜；
[0007] 所述第二激光器出射的激光被第二二色镜反射后，与来自第一激光器并经第二二色镜透射的激光合束，经过第三透镜、第一二色镜后被聚焦在物镜的后焦平面处，宽场照明样品台上的整个样品，激活样品内部分的荧光标记；
[0008] 所述第一激光器出射的激光从物镜出射后将在物镜的焦平面处产生时域聚焦，激发样品台上处于时域聚焦平面的已被第二激光器激活的样品的荧光；
[0009] 所述样品台移动时，物镜出射的激光的时域聚焦平面处于样品的不同深度，激发样品不同深度处的荧光，实现对样品中被激活的荧光标记的逐层扫描；
[0010] 所述样品中被激发的荧光沿激光传播相反的方向传输，重新进入物镜，然后被第一二色镜反射后，再依次通过滤光片、第四透镜，最后被探测器接收并成像。
[0011] 本发明的探测器得到的多个荧光图像，一般需要信号处理单元对探测器接收的每个时域聚焦平面的荧光信号进行拼接，获得整个样品的三维超分辨结构。所述信号处理单元可以是为本发明三维超分辨显微系统专配的单一拼接图像处理器也可以直接采用现有的工业计算机。当然，为便于研究和分析，本发明的三维超分辨显微系统还可以包括具有图像显示功能、或者/和参数设置或者/和命令输入等功能的显示器，可以是为本发明三维超分辨显微系统专配的显示器，也可以直接采用现有的工业计算机配套的显示器等。所述拼接操作为现有技术，可通过现有的软件或者编程实现。
[0012] 作为优选，所述扩束准直单元包括同轴设置的第一透镜和第二透镜，第一透镜和第二透镜共焦放置，第一透镜靠近第一激光器设置，且第一透镜焦距小于第二透镜。本发明中，所述第一透镜和第二透镜用于将激光光束扩束准直，使得激光光束直径变大，发散角变小，更接近于平行光，有利于激光光束会聚形成更小的光斑；第一透镜和第二透镜一般选择凸透镜。
[0013] 本发明中，所述的时域聚焦，是指单个飞秒脉冲的所有频率仅在物镜的聚焦平面上重和，并且彼此同相位，从而使脉冲在时域上的宽度极窄的聚焦效应；即时域聚焦时，将聚焦于整个聚焦平面，并且焦深极小，只激发样品位于时域聚焦平面内极薄层的荧光。
[0014] 本发明的抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统的一次工作循环包含以下步骤：
[0015] 步骤A：所述第二激光器出射的激光被第二二色镜反射后，与来自第一激光器的激光合束，经过第三透镜、第一二色镜后进入物镜，宽场照明样品台上的整个样品，激活样品内部分的荧光标记；
[0016] 步骤B：所述第一激光器出射的激光经过第一透镜、第二透镜后，倾斜入射到相位光栅表面，并被相位光栅反射；经过相位光栅反射后的激光经过第二二色镜、第三透镜和第一二色镜后，被聚焦到物镜的后焦平面处；第一激光器出射的激光从物镜出射后将在物镜的焦平面处产生时域聚焦，激发样品台上处于时域聚焦平面的已被第二激光器激活的样品的荧光；结合样品台的相对物镜移动，物镜出射的激光的时域聚焦平面可处于样品的不同深度，激发样品不同深度处的荧光，实现对步骤A中样品中被激活的荧光标记的逐层扫描；样品中被激发的荧光沿激光传播相反的方向传输，重新进入物镜，之后被第一二色镜反射；
被反射的荧光依次通过滤光片、第四透镜，被探测器接收并成像；
[0017] 步骤C：所述第二激光器出射的激光持续照射样品，直到将步骤A中激活的样品内部分的荧光标记漂白为止；
[0018] 重复步骤A、B、C的工作循环，直到样品中所有的分子被定位成像；最后经过信号处理单元对探测器接收的每个时域聚焦平面的荧光信号进行拼接，获得整个样品的三维超分辨结构。
[0019] 通过控制第二激光器的出射光强(小于1毫瓦)，控制被重新激活的荧光标记的比例(<<1％)。
[0020] 作为优选，本发明中，所述第一激光器为飞秒激光器，出射的激光强度大，脉冲宽度为飞秒量级，出射激光的光谱带宽为10纳米。
[0021] 作为进一步优选，所述第一激光器为钛蓝宝石飞秒激光器，最终输出峰值波长为830纳米，光谱带宽为10纳米，脉冲宽度小于100飞秒，输出平均功率为1.5瓦。采用该技术方案，可以在保证双光子激发效率的同时，减少对于非成像平面荧光标记的漂白，改善系统在整个三维成像区域的成像质量。
[0022] 作为优选，本发明中，所述的第二激光器为连续光激光器。作为进一步优选，所述第二激光器为连续光半导体激光器，输出波长为405纳米。
[0023] 本发明中，所述相位光栅用于调节第一激光器出射激光的相位，使得激光光束中不同波长的光同级衍射的衍射角度不一致，即激光发生色散，激光光束中不同波长的激光在相位光栅表面反射角度不同，但同波长的激光光束仍为平行光。本发明通过引入相位光栅，使得第一激光器发射的激光中的不同波长的光在光学元件中经过的路径不同，最终展宽了飞秒激光的脉冲宽度。作为进一步优选，扩束准直后的激光以26.44°入射到相位光栅的表面。
[0024] 本发明中，所述第三透镜用于将相位光栅反射后的激光聚焦，聚焦位置位于物镜的后焦平面处，其中激光光束中不同频率的激光将汇聚于物镜的后焦平面的不同位置。
[0025] 本发明中，所述第二二色镜用于使来自第一激光器与第二激光器的光束进行合束。作为优选，所述第二二色镜对于405纳米激光具有高反射率，反射率大于90％，对于825至835纳米激光具有高透射率，透射率大于90％。
[0026] 本发明中，所述第一二色镜用于透射激光，反射样品的荧光。作为优选，所述第一二色镜相对第三透镜倾斜45°放置。作为优选，第一二色镜包括两个透射带：分别为825纳米至835纳米以及400至410纳米；同时，第一二色镜反射500纳米至600纳米的光，反射率>95％。
[0027] 本发明中，所述滤光片只透射样品的荧光，过滤其余杂散光。
[0028] 作为优选，所述第四透镜为场镜，可有效减小探测器的尺寸。
[0029] 本发明提到的“第一”“第二”“第三”等仅仅是为了区别不同的部件，在没有特殊说明的情况下，“第一”“第二”“第三”等对这些部件的连接次序、结构以及功能等等没有限定作用。
[0030] 本发明利用时域聚焦特性，只在时域聚焦平面产生样品的荧光激发，并同时实现对整个时域聚焦平面内荧光的激发。与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0031] 1、本发明可以有效克服现有SMS荧光显微技术对聚焦平面附近甚至焦平面几微米附近等非观察区域的荧光激发，避免对的漂白。
[0032] 2、本发明可以实现对整个聚焦平面内荧光的激发，能够有效提高SMS荧光显微技术的工作效率。
