一种快速催化降解己烯雌酚的方法   0    0

[0001] 本发明涉及环境污染处理技术领域，特别是涉及一种快速催化降解己烯雌酚的方法。

[0002] 己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)是一种人工合成的雌激素类物质，属于内分泌干扰物之一。己烯雌酚具有与天然雌二醇相同的生理作用，主要用于临床中，但其类似激素的特性影响人和动物体内正常的激素功能，容易导致人和动物出现内分泌失衡的情况，并且己烯雌酚是脂溶性物质，易在动物体内残留，即使排出体外也会在水源和土壤中富积，造成环境激素污染恶性循环，严重威胁人类和野生动物的物种繁衍和长期生存。目前已在动物源性食品和水质中检测到己烯雌酚，因此对己烯雌酚的环境治理迫在眉睫。

[0003] 生物降解法越来越受关注，与传统工艺相比利用生物酶降解具有能耗低、操作简单、无毒性、成本低等优点。这些优点使得酶处理技术成为为污染物处理的重要方式。漆酶由于其高反应性和低特异性备受关注。漆酶作为一种环境友好型催化剂，可降解环境中多种有机污染物。基于上述问题，本发明提供了一种快速催化降解DES的方法，该方法催化降解效率高，操作简单，不会对环境产生二次污染，具有巨大的实际应用价值。

[0004] 本发明的目的是提供一种快速催化降解己烯雌酚的方法，利用漆酶实现己烯雌酚的快速降解，操作简单，效果显著，且无二次污染。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0006] 本发明提供一种快速催化降解己烯雌酚的方法，包括以下步骤：

[0007] (1)将己烯雌酚溶于甲醇中形成己烯雌酚母液，将漆酶溶于水中形成漆酶母液，配制乙酸‑乙酸钠缓冲溶液；

[0008] (2)将己烯雌酚母液稀释成不同浓度的标准液，利用HPLC检测峰面积制作己烯雌酚标准曲线；

[0009] (3)将漆酶母液与己烯雌酚母液混合于10mL反应体系中；

[0010] (4)反应不同时间后，利用乙酸乙酯萃取己烯雌酚终止反应，完成降解，利用HPLC检测剩余己烯雌酚浓度，计算降解率。

[0011] 优选的，所述己烯雌酚母液的浓度为2.5g/L。

[0012] 优选的，所述漆酶母液浓度为1mg/L。

[0013] 优选的，乙酸‑乙酸钠缓冲溶液pH为3‑8。

[0014] 优选的，步骤(2)中将己烯雌酚母液稀释成1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L的标准液。

[0015] 优选的，所述漆酶母液与所述己烯雌酚母液的混合体积比为5:2。

[0016] 优选的，反应体系温度为25‑75℃。

[0017] 优选的，反应时间为0.5‑6h。

[0018] 优选的，所述漆酶酶活为0.94U/mg。

[0019] 优选的，所述HPLC色谱柱：ZORBAX SB‑C18(150mm×4.6mm×5μm)；检测条件为：进样体积10μL，以等体积的乙腈和水为流动相等梯度洗脱10min，泵流速为1.0mL/min，柱温：30℃，紫外检测器检测240nm波长处的出峰情况，记录峰面积值。

[0020] 本发明提供了快速降解己烯雌酚的方法，利用漆酶来实现己烯雌酚的快速催化降解。本发明效率高、操作简单、成本低，有利于污水的快速处理，在环境污染物处理领域有实际应用价值。

[0025] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0026] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0027] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0028] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

[0029] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0030] 绘制己烯雌酚标准曲线

[0031] 己烯雌酚母液的配置：准确称取己烯雌酚0.125g，用甲醇溶解，并定容于50mL容量瓶，得到2.5g/L的己烯雌酚母液。用甲醇逐级稀释母液，分别得到1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L的标准溶液。绘制己烯雌酚标准曲线，见图1。用无菌注射器分别取
1mL，经0.45μm有机膜过滤待测。

[0032] 实施例1

[0033] (1)将0.5mL 1mg/L漆酶、9.5mL pH5.5的醋酸缓冲溶液、200μL2.5g/L己烯雌酚加入50mL锥形瓶中并放于35℃振荡培养箱中反应；

[0034] (2)将(1)中溶液反应0.5h后，利用乙酸乙酯萃取两次，收集有机相用旋转蒸发仪蒸发至尽干，加入5mL色谱级甲醇定容，用2mL注射器吸取适量，过0.22μm有机相微孔滤膜至液相进样瓶，最后用HPLC检测峰面积；

[0035] (3)根据检测得到的峰面积带入己烯雌酚标准曲线计算出反应体系剩余己烯雌酚浓度。根据公式降解率＝(C0‑C)/C0×100％计算降解率，其中C0是初始浓度，C是反应后剩余浓度，计算得到降解率为44.3％。

[0036] 实施例2

[0037] (1)将0.5mL 1mg/L漆酶、9.5mL pH5.5的醋酸缓冲溶液、200μL 2.5g/L己烯雌酚加入50mL锥形瓶中并放于35℃振荡培养箱中反应；

[0038] (2)将(1)中溶液反应1h后，利用乙酸乙酯萃取两次，收集有机相用旋转蒸发仪蒸发至尽干，加入5mL色谱级甲醇定容，用2mL注射器吸取适量，过0.22μm有机相微孔滤膜至液相进样瓶，最后用HPLC检测，计算得到降解率为48.9％。

[0039] 实施例3

[0040] (1)将0.5mL 1mg/L漆酶、9.5mL pH5.5的醋酸缓冲溶液、200μL2.5g/L己烯雌酚加入50mL锥形瓶中并放于35℃振荡培养箱中反应；

[0041] (2)将(1)中溶液反应2h后，利用乙酸乙酯萃取两次，收集有机相用旋转蒸发仪蒸发至尽干，加入5mL色谱级甲醇定容，用2mL注射器吸取适量，过0.22μm有机相微孔滤膜至液相进样瓶，最后用HPLC检测，计算得到降解率为58.6％。

[0042] 实施例4

[0043] (1)将0.5mL 1mg/L漆酶、9.5mL pH5.5的醋酸缓冲溶液、200μL2.5g/L己烯雌酚加入50mL锥形瓶中并放于35℃振荡培养箱中反应；

[0044] (2)将(1)中溶液反应4h后，利用乙酸乙酯萃取两次，收集有机相用旋转蒸发仪蒸发至尽干，加入5mL色谱级甲醇定容，用2mL注射器吸取适量，过0.22μm有机相微孔滤膜至液相进样瓶，最后用HPLC检测，计算得到降解率为71.9％。

[0045] 实施例5

[0046] (1)将0.5mL 1mg/L漆酶、9.5mL pH5.5的醋酸缓冲溶液、200μL2.5g/L己烯雌酚加入50mL锥形瓶中并放于35℃振荡培养箱中反应；

[0047] (2)将(1)中溶液反应6h后，利用乙酸乙酯萃取两次，收集有机相用旋转蒸发仪蒸发至尽干，加入5mL色谱级甲醇定容，用2mL注射器吸取适量，过0.22μm有机相微孔滤膜至液相进样瓶，最后用HPLC检测，计算得到降解率为93.1％。

[0048] 由于现有技术中并未公开漆酶降解己烯雌酚的技术方案，本发明采用分子计算模拟和实验相结合的方法研究了漆酶对DES的生物转化作用。利用分子对接研究漆酶与DES相互作用的结合位点及相互作用力。分子对接的操作过程为本领域的常规技术手段，且并非本发明重点，在此不再阐述。

[0049] 本发明基于AutoDock程序的分子对接研究提供了对小分子和生物大分子之间潜在相互作用的深入了解，从多次对接中得到最大构象簇位于最低能量等级并计算得到其结合能为‑5.99kcal/mol，理论预测漆酶与DES能够自发进行。如图3(a)中为漆酶与DES的最佳结合构象示意图，其清楚的显示了DES在漆酶上的结合位置。从图3a中右下图可以发现DES并没有完全进入漆酶的肽链空腔，而是依附在漆酶空腔的凹槽，这可能是由于DES的空间位阻导致的。如图3(a)所示，DES依附在漆酶的空腔处并且主要被残基Asp128、Lys40、Gln102、Ala103、Asn227、Gly225、Ile226、Ala309、Met311、Asp101、Leu308包围。在图3(b)中不难发现DES与漆酶中的Ala309、Asp128残基结合形成氢键，且均与DES的酚羟基相连。此外，DES与漆酶中的残基Lys40、Gln102、Ala103、Asn227、Gly225、Ile226、Met311、Asp101、Leu308形成“半包裹”的疏水界面。这些结果表明漆酶与DES能够自行发生反应，且氢键和疏水相互作用是形成漆酶‑DES复合物的重要作用力。

[0050] 综上所述可见，本发明所提供的快速降解己烯雌酚的方法，利用漆酶进行生物催化降解，50mg/L的己烯雌酚在反应6h后降解率达到93.1％。所述降解方法是一种操作简单、高效、成本低的方法，有利于污水的快速处理，在环境污染物处理领域有实际应用价值。

[0051] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0022] 图1为己烯雌酚标准曲线；

[0023] 图2为初始浓度为50mg/L己烯雌酚溶液随时间变化的降解曲线；

[0024] 图3为漆酶与DES分子对接的结果，图3(a)中为漆酶与DES的最佳结合构象示意图,图3(b)中为漆酶与DES的疏水作用图。