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一种与家蚕细胞凋亡相关的miRNA在抗病毒感染中的应用 0 0

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申请进展

基本信息

申请人信息

代理人信息

摘要

法律状态

权利要求

说明书

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2015-12-28

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2016-06-08

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

2019-07-23

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2035-12-28

基本信息

有效性	有效专利	专利类型	发明专利
申请号	CN201511007518.9	申请日	2015-12-28
公开/公告号	CN105561340B	公开/公告日	2019-07-23
授权日	2019-07-23	预估到期日	2035-12-28
申请年	2015年	公开/公告年	2019年
缴费截止日
分类号	A61K48/00 、A61K31/713 、A61K31/7088 、A61P31/20	主分类号	A61K48/00
是否联合申请	独立申请	文献类型号	B
独权数量	1	从权数量	5
权利要求数量	6	非专利引证数量	1
引用专利数量	0	被引证专利数量	0
非专利引证	1、王雅婷.bmo-miR-3378在家蚕细胞抗BmNPV感染中的功能研究《.中国优秀硕士学位论文全文数据库》.2017,(第04期),姜春来等.昆虫miRNAs功能研究进展《.中国细胞生物学学报》.2014,第36卷(第3期),高坤等.家蚕感染质型多角体病毒(BmCPV)后中肠组织差异蛋白质分析《.中国农业科学》.2013,第46卷(第13期),陈蔚等.利用生物信息学方法预测家蚕核型多角体病毒基因组编码的miRNA《.蚕业科学》.2011,(第5期),Ping Wu等.Involvement of MicroRNAs inInfection of Silkworm with Bombyx moriCytoplasmic Polyhedrosis Virus (BmCPV). 《PLOS ONE》.2013,第8卷(第7期),Yimei Cai等.Novel microRNAs insilkworm (Bombyx mori)《.Funct IntegrGenomics》.2010,第10卷高丽霞等.家蚕miRNA对核型多角体病毒靶基因的预测《.贵州农业科学》.2018,第46卷(第1期),Xiaomin Yu等.The Silkworm (Bombyxmori) microRNAs and Their Expressions inMultiple Developmental Stages《.PLoS ONE》.2008,第3卷(第8期),;
引用专利		被引证专利
专利权维持	7	专利申请国编码	CN
专利事件		事务标签	公开、实质审查、授权

申请人信息

申请人	浙江理工大学	第一申请人	浙江理工大学
专利权人	浙江理工大学	当前专利权人	浙江理工大学
发明人	蒋彩英	第一发明人	蒋彩英
地址	浙江省杭州市下沙高教园区2号大街5号	邮编	310018
申请人数量	1	发明人数量	1
申请人所在省	浙江省	申请人所在市	浙江省杭州市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

杭州天勤知识产权代理有限公司

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

沈自军

摘要

本发明公开了一种与家蚕细胞凋亡相关的miRNA在抗病毒感染中的应用。本发明发现bmo‑miR‑3378在家蚕BmN细胞感染BmNPV的过程中表达量显著降低，说明其在病毒与寄主互作中的具有特定的功能；并通过实验证明bmo‑miR‑3378能够通过调控BmN细胞的凋亡，进而影响病毒的增殖与侵染，其可以作为调控杆状病毒感染的新的小RNA，对当前蚕业生产中的家蚕抗病毒防治与育种以及促进家蚕生物反应器产业化发展具有重要的现实意义。

摘要附图
说明书附图：图1
说明书附图：图2
说明书附图：图3
说明书附图：图4
说明书附图：图5
说明书附图：图6
说明书附图：图7
说明书附图：图8
说明书附图：图9
说明书附图：图10
说明书附图：图11

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2019-07-23	授权
2	2016-06-08	实质审查的生效	IPC(主分类): A61K 48/00 专利申请号: 201511007518.9 申请日: 2015.12.28
3	2016-05-11	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1.bmo-miR-3378在促进受杆状病毒感染的家蚕细胞凋亡中的应用，其特征在于，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞；所述杆状病毒为核型多角体病毒；所述应用为非治疗目的的应用。

2.bmo-miR-3378在制备抗家蚕杆状病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述杆状病毒为核型多角体病毒。

3.bmo-miR-3378类似物在促进受杆状病毒感染的家蚕细胞凋亡中的应用，其特征在于，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞；所述bmo-miR-3378类似物为双链RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述杆状病毒为核型多角体病毒；所述应用为非治疗目的的应用。

4.bmo-miR-3378类似物在制备抗家蚕杆状病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述bmo-miR-3378类似物为双链RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
所述杆状病毒为核型多角体病毒。

5.bmo-miR-3378抑制物在抑制受杆状病毒感染的家蚕细胞凋亡中的应用，其特征在于，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞；所述bmo-miR-3378抑制物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述杆状病毒为核型多角体病毒。

6.bmo-miR-3378抑制物在家蚕生物反应器中促进重组杆状病毒增殖与侵染的应用，其特征在于，所述bmo-miR-3378抑制物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述杆状病毒为核型多角体病毒。

说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种与家蚕细胞凋亡相关的miRNA在抗病毒感染中的应用。

背景技术

[0002] 家蚕(Bombyx mori)是世界上重要的经济昆虫。我国是全球最大的蚕茧、蚕丝生产国和茧丝绸出口国(顾国达等，2002)。蚕桑业在农业经济中占有重要地位，是农民收入的重要来源。此外，家蚕作为生物反应器用来表达、生产外源基因具有其特有的优势(张耀洲等，2008)。然而，蚕病的发生与流行严重影响着我国蚕桑产业的可持续发展。

[0003] 其中，家蚕核型多角体病毒(B.mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV，一种杆状病毒)引起的蚕脓病作为危害最为严重的一种病毒病，在世界养蚕国家常有暴发，且传染强、难控制，并极易造成巨大的经济损失。

[0004] 目前，我国四川、浙江、江苏和广东等蚕业主产区，每年由BmNPV引起蚕茧损失，约占蚕病总损失的70～80％。长期以来，尽管在家蚕抗病毒机理研究和抗性品种培育等方面己取得进展，但仍有较多问题尚未解决(吕鸿声，2008)。而且，家蚕生物反应器亦存在着寄主范围窄、特异性高和外源基因可能与家蚕体内对BmNPV调控机制的互作而出现基因沉默现象等问题，严重制约利用家蚕生物反应器产业化开发有用蛋白的生物农场发展。

[0005] 研究表明，杆状病毒感染能诱导寄主昆虫细胞凋亡(Apoptosis)(庞义等，1998)，而细胞凋亡则被认为是昆虫防卫病毒侵染的一种重要机制，主要通过寄主细胞的自杀性死亡以限制病毒的感染与复制(Schultz等，2009；Vandergaast等，2011)。在寄主细胞中存在多种凋亡调控蛋白如凋亡抑制蛋白(Inhibitors of apoptosis proteins，IAPs)(Verhagen等，2001)和API5(Apoptosis inhibitor-5)(Morris等，2006)等，可调节细胞凋亡的发生与终止。事实上，IAPs最早是在昆虫病毒中发现的，可阻止寄主细胞凋亡而实现病毒复制与增殖(Clem等，2007；Sahdev等，2010)。因此，在病毒侵染早期，通过促进感染病毒的寄主细胞发生凋亡是有效的抗病毒策略之一。

[0006] 小RNA(microRNAs，简写miRNA或miR)是一类长度在18～25个碱基的具有调控作用的非编码RNA核酸分子。小RNA在基因的转录后调控中起着重要作用，参与昆虫发育、生殖、神经发生、代谢、免疫及细胞凋亡等各种生物过程。

[0007] 研究表明，小RNA亦能参与对病毒侵染免疫反应的调控过程(Fullaondo等，2012；Hussain等，2014)。目前，已在家蚕体内发现487条小RNA前体和563条成熟的小RNA(miRBase v21，2014)。其中，bmo-miR-3378最早于2010年由Cai Yi-Mei等人采用SOLiD测序技术在家蚕全虫和丝腺中鉴定获得，经预测发现有43个潜在靶基因，主要涉及胚胎发育、细胞分裂、囊泡运输和神经受体以及肿瘤发生、病原微生物感染等，但bmo-miR-3378在家蚕体内的功能与作用机制至今未有任何报道。

发明内容

[0008] 本发明发现家蚕microRNAs中的bmo-miR-3378能够促进家蚕细胞的凋亡，并通过家蚕细胞的凋亡来抑制家蚕细胞中杆状病毒的增殖，从而实现对感染杆状病毒的家蚕的防治。

[0009] 本发明发现了bmo-miR-3378在促进家蚕细胞凋亡中的应用。

[0010] 具体地，所述的家蚕细胞为家蚕BmN细胞。

[0011] 本发明发现了bmo-miR-3378在制备抗家蚕杆状病毒感染药物中的应用。

[0012] 作为优选，所述杆状病毒为核型多角体病毒。

[0013] 本发明提供了bmo-miR-3378类似物在促进家蚕细胞凋亡中的应用，其特征在于，所述bmo-miR-3378类似物为双链RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

[0014] 本发明提供了bmo-miR-3378类似物在制备抗家蚕杆状病毒感染的药物中的应用，所述bmo-miR-3378类似物为双链RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

[0015] 本发明提供了bmo-miR-3378抑制物在抑制家蚕细胞凋亡中的应用，所述bmo-miR-3378抑制物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

[0016] 本发明还提供了bmo-miR-3378抑制物在家蚕生物反应器中促进重组杆状病毒增殖与侵染的应用，所述bmo-miR-3378抑制物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

[0017] 本发明还提供了一种家蚕杆状病毒病的防治方法，包括：采用bmo-miR-3378或其类似物转染受杆状病毒感染的家蚕细胞；所述bmo-miR-3378的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述类似物的为双链RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

[0018] 为了验证上述发现，本发明采用qRT-PCR法明确家蚕BmN细胞感染BmNPV以及转染bmo-miR-3378类似物与抑制物后bmo-miR-3378表达量的变化，然后分别采用Caspase活性检测法、MTT法、qRT-PCR法和Reed-Muench终点稀释法研究了bmo-miR-3378表达量变化对感染BmNPV的家蚕BmN细胞凋亡与活力、以及BmNPV复制与致病力的影响。结果表明，bmo-miR-3378可通过促进BmN细胞凋亡而抑制BmNPV增殖和侵染。

[0019] 具体内容如下：

[0020] 本发明采用茎环法设计、合成bmo-miR-3378特异性PCR引物，并采用qRT-PCR法检测比较了家蚕BmN细胞感染BmNPV后bmo-miR-3378的表达量变化。结果发现，在家蚕BmN细胞感染BmNPV后12h和24h，bmo-miR-3378表达量出现显著降低(p<0.05)。

[0021] 随后，发明人合成bmo-miR-3378类似物与抑制物，分别转染家蚕BmN细胞，并采用qRT-PCR法检测bmo-miR-3378的表达水平。结果发现，家蚕BmN细胞转染bmo-miR-3378类似物后，bmo-miR-3378表达量极显著升高(p<0.05)；而转染bmo-miR-3378抑制物后的表达量极显著降低(p<0.01)。

[0022] 在此基础上，发明人对分别转染bmo-miR-3378类似物与抑制物的家蚕BmN细胞进行病毒感染处理，采用Caspase活性检测法测定BmN细胞的凋亡诱导情况。结果发现，经bmo-miR-3378类似物处理的BmN细胞在接毒24h之内，细胞凋亡水平显著增高(p<0.05)；而经bmo-miR-3378抑制物处理的BmN细胞在接毒48h之内，细胞凋亡水平显著降低(p<0.05)。这表明bmo-miR-3378表达量升高或降低可分别显著诱导或抑制寄主细胞对病毒的凋亡反应。

[0023] 最后，本发明应用bmo-miR-3378类似物与抑制物处理家蚕BmN细胞，然后分别采用MTT法评价BmN细胞活力、采用qRT-PCR法评价BmNPV在处理细胞中的增殖力和采用Reed-Muench终点稀释法评价处理细胞中BmNPV的感染力等。结果表明，经bmo-miR-3378类似物处理的BmN细胞感染BmNPV后：细胞活力明显降低，且在接毒24h以后差异达到显著水平(p<0.05)；细胞中的BmNPV的DNA拷贝数在接毒72h内均显著降低(p<0.05)；BmNPV的滴度亦显著降低(p<0.05)。与此对应，经bmo-miR-3378抑制物处理的BmN细感染BmNPV后，相关的指标均呈现相反变化。

[0024] 上述结果表明，bmo-miR-3378可通过调控寄主细胞凋亡而影响病毒的复制与侵染。因此，bmo-miR-3378可作为双向调控分子而应用于促进或抑制病毒在寄主细胞中的侵染与增殖。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0026] 本发明发现bmo-miR-3378在家蚕BmN细胞感染BmNPV的过程中表达量显著降低，说明其在病毒与寄主互作中的具有特定的功能；并通过实验证明bmo-miR-3378能够通过调控BmN细胞的凋亡，进而影响病毒的增殖与侵染，其可以作为调控杆状病毒感染的新的小RNA，对当前蚕业生产中的家蚕抗病毒防治与育种以及促进家蚕生物反应器产业化发展具有重要的现实意义。

实施方案

[0038] 下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并非仅限于此。

[0039] bmo-miR-3378的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明实施案例中所使用的细胞培养液Sf-900TM II SFM(1×)和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，转染用脂质体Lipofectamine LTX&PLUS Reagent和细胞RNA提取用TRIzol Reagent等均购自美国Life Technologies公司；RNA逆转录用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、qRT-PCR用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)和病毒DNA提取用High Pure Viral Nucleic Acid Kid等均购自美国Roche公司；细胞凋亡检测用CaspACE Assay System(Colrimetric)购自美国Promega公司；细胞活力检测用MTT购自碧云天生物技术有限公司。家蚕bmo-miR-3378类似物及其对照、bmo-miR-3378抑制物及其对照由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成；具体序列如下：

[0040]

[0041]

[0042] 以下实施案例设计的检测方法如下：

[0043] 1.家蚕BmN细胞的转染

[0044] (1)在24孔板中接入状态良好的BmN细胞约1×105个/孔后，27℃培养过夜，使细胞50％～70％铺满培养孔；

[0045] (2)稀释bmo-miR-3378类似物：取1.25μL 20μM bmo-miR-3378类似物储存液于Nuclease-Free EP管中，用Sf-900II SFM培养液稀释到50μL，轻轻吹吸5次混匀，室温孵育5min；

[0046] (3)稀释脂质体：轻轻上下颠倒混匀Lipofectamine LTX&PLUS试剂，快速离心至管底，取2μL于Nuclease-Free EP管中，用Sf-900II SFM培养液稀释成50μL脂质体稀释液，轻轻吹打5次使之混匀，室温放置5min；

[0047] (4)制备脂质体与bmo-miR-3378类似物混合液：将50μL脂质体稀释液与50μL bmo-miR-3378类似物稀释液轻轻混匀，室温下孵育20min；

[0048] (5)在孵育结束前，吸除孔板中的培养基，用Sf-900II SFM培养液清洗细胞培养孔，轻轻滴加400μL培养基于细胞培养孔中；

[0049] (6)在孵育结束后，将脂质体与bmo-miR-3378类似物混合液滴加到细胞上；

[0050] (7)27℃培养5h后将细胞培养基换成加有10％胎牛血清的Sf-900II SFM培养液；

[0051] (8)27℃培养48h后采用qRT-PCR方法定量检测bmo-miR-3378的表达量。

[0052] 转染实验中，每个转染样品设置3个重复孔。bmo-miR-3378类似物对照的加样量与bmo-miR-3378类似物相同；bmo-miR-3378抑制物及其对照的加样量是类似物的2倍。

[0053] 2.BmNPV-DsRED重组病毒的活化

[0054] 取3mL新鲜并加有10％胎牛血清的Sf-900II SFM培养液加入新的T-25细胞培养瓶中，然后将生长状态良好的BmN细胞吹打均匀后，取2mL滴加到T-25细胞培养瓶中；轻轻混合细胞悬液后，置于27℃下培养。待细胞80％铺满培养瓶时，弃去旧培养液，加入新鲜培养液，并接入50μL BmNPV-DsRED重组病毒液，轻轻混匀后继续培养。培养3～4d后，待大部分细胞漂浮在培养液中时，收集富含BmNPV颗粒的培养液，用0.22μm滤膜过滤除去病毒液中的细胞碎片，用Reed-Muench终点稀释法测定活化后病毒的滴度。

[0055] 实施例1家蚕BmN细胞小RNA表达量的qRT-PCR检测

[0056] 取状态良好的BmN细胞接种于24孔细胞培养板中，27℃培养3～4h后，约80％细胞铺满细胞培养孔，随后按MOI＝0.15量接入BmNPV-DsRED重组病毒，或按上述方法分别转染bmo-miR-3378类似物及其对照、bmo-miR-3378抑制物及其对照，混匀后继续培养。

[0057] 1、细胞总RNA提取

[0058] (1)吸尽24孔培养板中的培养液，加入500μL Trizol，轻轻摇晃后冰上放置10min，用移液器吹打确保细胞完全裂解，将裂解液吸至离心管中；

[0059] (2)室温静置5min，加入0.1mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2min，4℃12000rpm离心15min，吸取上清至新RNase-free EP管中；

[0060] (3)加入0.25mL异丙醇，轻柔混匀，室温放置10min，4℃12000rpm离心10min，去上清，可见RNA沉淀；

[0061] (4)加入1.0mL DEPC水配置的75％乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm离心5min，小心吸尽液体，自然干燥，待RNA完全干燥前加入30μL DEPC水溶解。测定260nm和280nm等OD值，以检验RNA纯度及浓度，-80℃保存留用。

[0062] 2、cDNA合成

[0063] 根据茎环法分别设计、合成bmo-miR-3378的Stem-loop引物(序列如SEQ ID NO.2所示)、上游引物(序列如SEQ ID NO.3所示)和下游引物(序列如SEQ ID NO.4所示)。采用家蚕5S rRNA(B5S)为内参基因，分别设计并合成其上游引物(序列如SEQ ID NO.5所示)和下游引物(序列如SEQ ID NO.6所示)。

[0064] 按Roche公司Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit说明书配制逆转录反应体系液并设置反应程序：

[0065] (1)取新的Nuclease-Free EP管，依次加入1.0μg RNA、1.0μL 20μM Oligo dT或Random引物和1.0μL 10μM bmo-miR-3378Stem-loop引物，用RNase-Free水补足至13μL，轻轻吹打混匀；

[0066] (2)将反应液置于65℃水浴锅温育10min，水浴结束后立即置于冰上；

[0067] (3)依次加入4.0μL 5×Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer、0.5μL 40U/μL Protector RNase Inhibitor、2.0μL dNTP(10mM each)和0.5μL 20U/μL Transcriptor Reverse Transcriptase，轻轻混匀后甩至管底；

[0068] (4)逆转录反应条件如下：55℃30min，85℃5min，冰上冷却后得到cDNA，-20℃保存。

[0069] 3、qRT-PCR检测

[0070] 以50×稀释的cDNA为模板，按Roche公司Faststart Universal SYBR Green Master(Rox)说明书配制qPCR的体系并设置反应程序：

[0071] 取新PCR管依次加入FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10μL、10μM上下游引物各0.6μL和cDNA模板1.5μL，用PCR-grade水补足至20μL。混匀后甩至管底，使用ABI 7300荧光定量PCR仪进行qPCR检测。反应条件：95℃预变性10min；95℃15s，60℃60s，共40个循环。同时以B5S基因为内参基因，应用ABI 7300System分析获得PCR扩增的实验数据，采用2-ΔΔCt相对定量法计算比较表达量位数差异。

[0072] 茎环法qRT-PCR检测小RNA表达量的结果如图1-3所示。家蚕细胞在感染病毒早期(24h内)，bmo-miR-3378表达量出现显著降低；而转染bmo-miR-3378类似物或抑制物后，bmo-miR-3378表达量分别出现显著增高或显著降低。这表明bmo-miR-3378在BmNPV感染家蚕细胞过程中具有一定作用。同时，本发明构建的BmN细胞bmo-miR-3378过表达/抑制表达处理与检测体系是有效的。

[0073] 实施例2 bmo-miR-3378对家蚕BmN细胞诱导凋亡影响的Caspase活性检测[0074] 按上述方法对BmN细胞转染bmo-miR-3378类似物或抑制物及其各自对照48h后，以MOI＝0.15量接入BmNPV-DsRED重组病毒。

[0075] (1)在接毒培养12h、24h、48h和72h后分别收集细胞，4℃1000rpm离心10min；

[0076] (2)用冰冷PBS缓冲液洗涤细胞沉淀，4℃1000rpm离心10min；

[0077] (3)弃去PBS缓冲液，加入Promega公司CaspACE Assay System(Colrimetric)试剂盒中的细胞裂解液重悬细胞；

[0078] (4)置于-80℃下约2min使细胞液完全冰冻，随后冰上解冻约20min；

[0079] (5)待细胞液完全解冻后，冰上静置15min；

[0080] (6)重复冻融1次以确保细胞被完全裂解，4℃13000rpm离心20min，取上清用于凋亡检测或储存于-80℃备用。

[0081] 按照CaspACE Assay System(Colrimetric)试剂盒说明书处理样品后，在多功能酶标仪上检测各样品在405nm处的吸光度值。

[0082] 检测结果如图4-5所示。经bmo-miR-3378类似物转染处理后，家蚕细胞的凋亡水平在病毒感染早期(24h内)呈极显著增高(p<0.01)，后随时间延长而差异不再显著；经bmo-miR-3378抑制物转染处理后，家蚕细胞的凋亡水平在病毒感染后48h内均呈显著降低(p<0.05)。这表明bmo-miR-3378表达量变化可显著影响家蚕细胞对病毒的凋亡反应。

[0083] 实施例3 bmo-miR-3378对家蚕BmN细胞活力影响的MTT活性检测

[0084] 按上述方法对BmN细胞转染bmo-miR-3378类似物或抑制物及其各自对照48h后，以MOI＝0.15量接入BmNPV-DsRED重组病毒。

[0085] 在接毒培养12h、24h、48h和72h后弃去原培养液，加入500μL新鲜无血清的Sf-900II SFM(1×)细胞培养液，再每孔加入25μL MTT，混匀后于27℃培养4h；吸去培养液后加入750μL DMSO；摇床震荡10min，采用多功能酶标仪在490nm波长处检测每孔的光密度。

[0086] 检测结果如图6-7所示。经bmo-miR-3378类似物转染处理后，家蚕细胞活力在病毒感染24h后呈显著增高；而经bmo-miR-3378抑制物转染处理后，家蚕细胞活力在病毒感染24h后却呈显著降低。这表明bmo-miR-3378表达量变化可显著影响家蚕细胞感染病毒后的活力。

[0087] 实施例4 bmo-miR-3378对BmNPV增殖力影响的qRT-PCR检测

[0088] 按上述方法对BmN细胞转染bmo-miR-3378类似物或抑制物及其各自对照48h后，以MOI＝0.15量接入BmNPV-DsRED重组病毒。

[0089] 在接毒培养12h、24h、48h和72h后分别收集细胞病毒悬液，取200μL按Roche公司High Pure Viral Nucleic Acid Kit说明书少量纯化病毒基因组DNA。

[0090] 设计并合成用于病毒qPCR的上游引物(序列如SEQ ID NO.7所示)和下游引物(序列如SEQ ID NO.8所示)，以病毒基因组DNA为模板，按上述的Roche公司Faststart Universal SYBR Green Master(Rox)说明书配制qPCR体系并设置反应程序，进行病毒定量PCR检测。

[0091] 测定纯化获得的病毒DNA样品浓度，根据下列公式计算每微升DNA样品中含有的BmNPV-DsRED拷贝数(Copies/μL)：DNA浓度(ng/μL)×6.02×1023×10-9/(660×bases)。其中，每个碱基分子量按660Da计算，阿伏伽德罗常数为6.02×1023，bases为DNA碱基数。以此计算获得病毒DNA标准品的拷贝数为1.49×1011copies/μL。将病毒DNA标准品用ddH2O按10倍梯度稀释后，分别取1μL作为模板进行qPCR反应，制作标准曲线，进而对各样品的病毒DNA进行定量分析。

[0092] 检测结果如图8-9所示。BmNPV感染经bmo-miR-3378类似物转染处理的家蚕细胞，病毒的DNA拷贝数在感染后72h内呈极显著降低；而感染经bmo-miR-3378抑制物转染处理的家蚕细胞，病毒的DNA拷贝数在感染后72h内却呈极显著增高。这表明bmo-miR-3378表达量变化可显著影响BmNPV在家蚕细胞中的增殖。

[0093] 实施例5 bmo-miR-3378对BmNPV感染力影响的Reed-Muench终点稀释检测[0094] 按上述方法对BmN细胞转染bmo-miR-3378类似物或抑制物及其各自对照48h后，以MOI＝0.15量接入BmNPV-DsRED重组病毒。在接毒培养12h、24h、48h和72h后分别收集细胞病毒悬液，用0.22μm滤膜过滤除去病毒液中的细胞碎片后，用细胞培养液按10×作10次连续梯度稀释。

[0095] 在96孔板中全部接入100μl BmN细胞(约6×104个/孔)，27℃下用含10％胎牛血清的Sf-900II SFM培养液培养3h。然后，将病毒稀释液按列(即8孔)分别接入细胞中，每孔接毒100μl；剩余2列细胞中加培养液100μl，设为对照。置于27℃下培养，每天在荧光显微镜下观察并记录每列出现红色荧光的孔数，并按照Reed-Muench法(Reed和Muench，1938)计算病毒的TCID50和MOI值。

[0096] 检测结果如图10-11所示。BmNPV感染经bmo-miR-3378类似物转染处理的家蚕细胞后，病毒的滴度水平呈极显著降低；而感染经bmo-miR-3378抑制物转染处理的家蚕细胞后，病毒的滴度水平却呈极显著增高。这表明bmo-miR-3378表达量变化可显著影响BmNPV对家蚕细胞的侵染力。

附图说明

[0027] 图1为BmNPV感染对家蚕BmN细胞中bmo-miR-3378表达量影响的qRT-PCR检测结果示意图。图中结果表明，家蚕细胞在感染病毒早期(24h内)，bmo-miR-3378表达量出现显著降低(p<0.05)。

[0028] 图2为bmo-miR-3378类似物对家蚕BmN细胞中bmo-miR-3378表达量影响的qRT-PCR检测结果示意图。结果表明，家蚕细胞在转染bmo-miR-3378类似物后，bmo-miR-3378表达量呈极显著增高(p<0.01)。这说明bmo-miR-3378类似物的处理具有bmo-miR-3378过表达的效果。

[0029] 图3为bmo-miR-3378抑制物对家蚕BmN细胞中bmo-miR-3378表达量影响的qRT-PCR检测结果示意图。结果表明，家蚕细胞在转染bmo-miR-3378抑制物后，bmo-miR-3378表达量呈极显著降低(p<0.01)。这说明bmo-miR-3378类似物处理具有bmo-miR-3378抑制沉默的效果。

[0030] 图4为bmo-miR-3378类似物对家蚕BmN细胞诱导凋亡影响的Caspase活性检测结果示意图。结果表明，经bmo-miR-3378类似物转染处理后，家蚕细胞的凋亡水平在病毒感染早期(24h内)呈极显著增高(p<0.01)，后随时间延长而差异不再显著。这表明bmo-miR-3378表达量增高可显著诱导细胞对病毒的凋亡反应。

[0031] 图5为bmo-miR-3378抑制物对家蚕BmN细胞诱导凋亡影响的Caspase活性检测结果示意图。结果表明，经bmo-miR-3378抑制物转染处理后，家蚕细胞的凋亡水平在病毒感染后48h内均呈显著降低(p<0.05)。这表明bmo-miR-3378表达量降低可显著抑制细胞对病毒的凋亡反应。

[0032] 图6为bmo-miR-3378类似物对家蚕BmN细胞活力影响的MTT活性检测结果示意图。结果表明，经bmo-miR-3378类似物转染处理后，家蚕细胞活力在病毒感染12h后呈显著增高(p<0.05)。这表明bmo-miR-3378表达量增高可显著增强细胞的活力。

[0033] 图7为bmo-miR-3378抑制物对家蚕BmN细胞活力影响的MTT活性检测结果示意图。结果表明，经bmo-miR-3378抑制物转染处理后，家蚕细胞活力在病毒感染24h后呈显著降低(p<0.05)。这表明bmo-miR-3378表达量降低可显著减弱细胞的活力。

[0034] 图8为bmo-miR-3378类似物对BmNPV增殖力影响的qRT-PCR检测结果示意图。结果表明，BmNPV感染经bmo-miR-3378类似物转染处理的家蚕细胞，病毒的DNA拷贝数在感染后72h内呈极显著降低(p<0.01)。这表明bmo-miR-3378表达量增高可显著抑制BmNPV的DNA复制水平。

[0035] 图9为bmo-miR-3378抑制物对BmNPV增殖力影响的qRT-PCR检测结果示意图。结果表明，BmNPV感染经bmo-miR-3378抑制物转染处理的家蚕细胞，病毒的DNA拷贝数在感染后72h内呈极显著增高(p<0.01)。这表明bmo-miR-3378表达量降低可显著增加BmNPV的DNA复制水平。

[0036] 图10为bmo-miR-3378类似物对BmNPV感染力影响的Reed-Muench检测结果示意图。结果表明，BmNPV感染经bmo-miR-3378类似物转染处理的家蚕细胞后，病毒的滴度水平呈极显著降低(p<0.01)。这表明bmo-miR-3378表达量增高可显著影响BmNPV的感染力。

[0037] 图11为bmo-miR-3378抑制物对BmNPV感染力影响的Reed-Muench检测结果示意图。结果表明，BmNPV感染经bmo-miR-3378抑制物转染处理的家蚕细胞后，病毒的滴度水平呈极显著增高(p<0.01)。这表明bmo-miR-3378表达量降低可显著提高BmNPV的感染力。

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