[0019] 下面通过实施例对本发明方案作进一步说明:
[0020] 实施例1:
[0021] 一株海洋假交替单胞菌,从中国浙江舟山朱家尖一处海水养殖场养殖的菲律宾蛤仔吐泥中分离筛选获得,经鉴定为假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.),于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No. 12913。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0022] 一株海洋假交替单胞菌的筛选方法为:采集新鲜菲律宾蛤仔,放入无菌水中吐泥,取1ml泥,采用梯度稀释倒平板分离和划线纯化,经活性测试筛选出具有高絮凝和脱色活性的菌株Pseudoalteromonassp. GHS18。
[0023] 一株海洋假交替单胞菌的脱色絮凝剂最优选制法,包括以下步骤:
[0024] 1)种子液培养:先在斜面培养基上接种保藏号为CGMCC No. 12913的海洋细菌Pseudoalteromonassp. GHS18,并于24℃恒温培养36h,将菌种活化,再加入培养基体积1.1倍的无菌水,振荡制得种子液;
[0025] 2)液体培养基的制备:按照以下成份及其浓度配置液体培养基:芦苇秸秆水解液200ml/L、硫酸铵0.7g/L、酵母膏0.5g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.3g/L和余量陈化海水;调节pH为7.3,121℃高压灭菌20min。其中,芦苇秸秆水解液的制备方法为:将芦苇秸秆切段烘干后粉碎过筛,按料液比1:8加入1.7%硫酸水解,水解温度为121℃,水解时间为
2h,水解完加入氢氧化钙调节至中性,高速离心取上清液即为芦苇秸秆水解液;
[0026] 3)扩大发酵培养:每100ml液体发酵培养基接入0.4ml种子液和8g载体,于25℃恒温摇床发酵培养;摇床速率为140r/min,发酵培养时间为36h;载体为菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土,沙土重量比组成为70%沙和30%土;
[0027] 4)絮凝剂的制备:将发酵液静置3h,取下层固体,冷冻干燥得到脱色絮凝剂。
[0028] 斜面培养基成分为:葡萄糖20g/L、尿素0.48g/L、硫酸铵0.21g/L、酵母膏0.54g/L、磷酸氢二钾3.8g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、琼脂16g/L和余量陈化海水;调节pH为7.3,121℃高压灭菌20min。
[0029] 实施例2:
[0030] 一株海洋假交替单胞菌的脱色絮凝剂制法,包括以下步骤:
[0031] 1)种子液培养:先在斜面培养基上接种保藏号为CGMCC No. 12913的海洋细菌Pseudoalteromonassp. GHS18,并于22℃恒温培养72h,将菌种活化,再加入培养基体积1.3倍的无菌水,振荡制得种子液;
[0032] 2)液体培养基的制备:按照以下成份及其浓度配置液体培养基:水稻秸秆水解液250ml/L、硫酸铵1.0 g/L、酵母膏0.6g/L、磷酸氢二钾4.1g/L、磷酸二氢钾1.2g/L和余量人工海水;调节pH为7.4,115℃高压灭菌30min。其中,人工海水配方为:氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水
0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量。其中,水稻秸秆水解液的制备方法为:将水稻秸秆切段烘干后粉碎过筛,按料液比1:10加入2.1%硫酸水解,水解温度为121℃,水解时间为1.5h,水解完加入氢氧化钙调节至中性,高速离心取上清液即为水稻秸秆水解液;
[0033] 3)扩大发酵培养:每100ml液体发酵培养基接入0.4ml种子液和9g载体,于24℃恒温摇床发酵培养;摇床速率为130r/min,发酵培养时间为72h;载体为菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土,沙土重量比组成为80%沙和20%土;
[0034] 4)絮凝剂的制备:将发酵液低速离心,取下层固体,喷雾干燥得到脱色絮凝剂。
[0035] 斜面培养基成分为:葡萄糖22g/L、尿素0.48g/L、硫酸铵0.20g/L、酵母膏0.6g/L、磷酸氢二钾3.1 g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、琼脂15g/L和余量人工海水;调节pH为7.3,121℃高压灭菌30min。其中,人工海水配方为:氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量。
[0036] 实施例3:絮凝活性的测定
[0037] 采用絮凝活性测试法 (R.Kurane,K.Takeda,T.Suzuki.Screening and Characteristeristics of Microbial Flocculants.Agric.Biol.Chem.1986 :2301-2307) 对高岭土悬浊液的絮凝活性进行测定,取5g/L的高岭土悬浊液93ml,加入5ml 1%(m/v)CaCl2做助凝剂,加入 2ml 实施例1样品,调节 pH 值为 9,混合快速搅拌 1min,再慢速搅拌 5min,静置 10min,取水平面下 1cm 处混合液,可见分光光度计测 550nm 下吸光度 A,同时以 2ml 蒸馏水代替样品作为对照,测吸光度 B,计算絮凝率,FR(% ) = (A-B)/A×100%。则絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝率为 91.87%。
[0038] 实施例4:脱色活性测定
[0039] 取10ml亚甲基蓝和孔雀石绿(10mg/L)以及10mL结晶紫(20mg/L)于大试管中,加入 1ml 浓度为 2g/L 的实施例1样品,漩涡振荡 1min,调节溶液 pH 值为9,静置 30min ,取水平面下 1cm 处的溶液,测定相应染料在最大吸收波长处的吸光度,脱色前溶液的吸光度为A,脱色后溶液的吸光度为A0,计算脱色率,DR(%) = (A-A0)/A×100%。则絮凝剂对亚甲基蓝、孔雀石绿和结晶紫的脱色率分别为 92.14%、99.45%和 98.61%。
[0040] 实施例5:沉降实验
[0041] 在培养进入生长稳定期的100ml新鲜小球藻藻液中加入1ml浓度为2g/L的实施例1样品,混合快速搅拌1min,再慢速搅拌5min,静置30min,小球藻沉降率78%。
[0042] 本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知,在此不进行赘述。
[0043] 以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等,均应包含在本发明的保护范围之内。