一株异养硝化好氧反硝化的皱褶念珠菌菌株及其应用   0    0

[0001] 本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一株异养硝化好氧反硝化的皱褶念珠菌菌株及其应用。

[0002] 随着淡水养殖水体富营养化问题日益严峻，造成许多大水面围网养殖、围栏养殖的取消及“退鱼还湖”等政策的实施，促使淡水养殖在我国养殖业中发挥了不可替代的作用。但是，随着养殖水平的日益提高以及单位水体载鱼量的增长，投放大量饲料及鱼类代谢物造成养殖水质严重污染，而养殖废水未经处理就直接排放到周围河道，导致周围水体富营养化的问题日益严重。

[0003] 氮素是水体污染中的一项重要污染物，其主要以有机氮和无机氮两种形式存在，有机氮包括如蛋白质、氨基酸、尿素等；无机氮主要有氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮。养殖污水中氮的去除方法分为物化脱氮法和生物脱氮法。物化脱氮法成本较高，难以推广应用。生物脱氮法被公认为是一种经济、有效、环保和最有发展前途的污水除氮方法。传统的生物脱氮途径包括好氧硝化和厌氧反硝化两个阶段，分别由硝化菌和反硝化菌完成。由于参与的菌群和工艺运行参数不同，硝化和反硝化两个过程需要在两个隔离的反应器中进行，或者在时间或空间上造成交替缺氧和好氧环境的同一个反应器中进行。近年来发现了一些异养硝化细菌、好氧反硝化细菌和异养硝化好氧反硝化细菌，可在同一个反应容器中完成脱氮全过程。与传统工艺相比，异养硝化‑好氧反硝化(Simultaneous Nitrification and Denitrification，SND)工艺可节省反应容器体积，缩短反应时间，操作管理方便，因而微生物脱氮已成为水污染控制领域研究的热点问题之一。

[0004] 近十几年来，国内外学者对异养硝化‑好氧反硝化菌进行了大量的研究。研究的菌株主要有副球菌属(paracoccus)、假单胞菌属(pseudomonas)、产碱杆菌属(alcaligenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(rhodococcuus)、不动杆菌属(Acinetobacter)等。Taylor Shauna M等从膜生物反应器中筛选得到一株雷氏普罗威登斯菌providencia rettgeri YL，在最优条件(C/N比为10,30℃，120r/min)下，当氨氮质量浓度为84.63mg/L时，接种该菌48h后总氮(TN)去除率为79％(Taylor Shauna M et al.Hetero‑trophic ammonium removal characteristics of an aerobic heterotrophic[J].Journal of Environmental Sciences,2009，21(10):1336‑1341.)；王晓静等从海底沉积物中分离出一株异养硝化‑好氧反硝化菌株Klebsiella sp.y6，研究表明:该菌株最适pH值为7.0，最佳C/N为17，最佳碳源为柠檬酸三钠。菌株y6在脱氮的同时能高效地去除有机物(王晓静等.海洋异养硝化‑好氧反硝化菌y6同步脱氮除碳特性[J].中国环境科学，2017,37(2):686‑695.)；
Chen等在加压生物膜反应器中开发了用于同时去除高盐度和高氮有机废水的系统。结果表
3
明，在200L/h的空气供应速率下，盐度为3.0±0.2％，有机负荷为10kgCOD/m/d，氮气负荷
3
为0.185kg/m/d，在30天操作后快速启动并稳定地进行。同时，在单级反应器中实现了COD
4+
和氮的同时降解，其中COD，NH ‑N和TN降解效率分别为97％，99％和98％(Chen  J etc.Start‑up and microbial communities of a simultaneous nitrogen removal system for  high salinity and  high nitrogen organic wastewater via heterotrophic nitrification[J].Bioresource Technology，2016，216:196‑202.)；
Zhang等测定了Microbacterium sp.strain SFA13的NAR和NIR，HAO的活性，其活性分别为
0.15μmol/min，0.21μmol/min和0.44μmol/min(Zhang D etc.Removal of ammonium in surface water at low temperature by a newly echnology,2013,137C(6):isolated Microba‑cterium sp.strain SFA13[J].Bioresource，147‑152.)。对于皱褶念珠菌的氮的降解功能及其应用于养殖污水处理，在国内外文献中未见报道。

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一株异养硝化好氧反硝化的皱褶念珠菌菌株及其应用，所述皱褶念珠菌菌株具有在好氧条件下进行异养硝化‑好氧反硝化的性能，且能高效去除淡水养殖水体中氮素。

[0006] 本发明提供了一株异养硝化好氧反硝化的皱褶念珠菌(Diutina rugosa)菌株DW‑1，保藏编号为CCTCC NO：M2019166。

[0007] 本发明提供了一种降解淡水养殖污水中氨氮和亚硝氮的微生物制剂，包括所述皱褶念珠菌(Diutina rugosa)菌株DW‑1。

[0008] 优选的，所述皱褶念珠菌(Diutina rugosa)菌株DW‑1的活菌浓度为1010～15
10 CFU/mL。

[0009] 本发明提供了所述皱褶念珠菌(Diutina rugosa)菌株DW‑1或所述微生物制剂在淡水水产养殖水体脱氮中的应用。

[0010] 优选的，所述淡水水产养殖水体脱氮的方法，包括以下步骤：

[0011] 在淡水养殖污水中接入皱褶念珠菌DW‑1菌株的菌液，进行好氧培养的同时进行脱氮处理。

[0012] 优选的，淡水水产养殖水体脱氮中的氮包括氨氮和/或亚硝氮。

[0013] 优选的，在淡水水产养殖水体中，氨氮和亚硝氮组成的总氮、氨氮或亚硝氮的浓度为40～100mg/L。

[0014] 优选的，所述皱褶念珠菌DW‑1菌株的菌液的活菌浓度为1010～1015CFU/mL；所述皱褶念珠菌DW‑1菌株的菌液的接种量为0.1％～1％。

[0015] 优选的，所述淡水养殖污水的初始pH值为4.0～8.5。

[0016] 优选的，在好氧培养期间，所述淡水养殖污水的溶氧量为1.5～3mg/L；

[0017] 所述好氧培养的培养温度为20～36℃，所述好氧培养的时间为24～48h，C/N比为10～25。

[0018] 本发明提供的异养硝化好氧反硝化的皱褶念珠菌(Diutina rugosa)菌株DW‑1，保藏编号为CCTCC NO：M2019166。本发明所提供的DW‑1菌株具有异养硝化‑好氧反硝化的功能，可将含氮污水中大部分氨氮通过异养硝化‑好氧反硝化作用直接转化为气体产物，亚硝酸盐和硝酸盐氮积累量较少；所述菌株DW‑1，可以以氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，氨氮去除率可达90.28％，氨氮降解速率达0.99mg/(L·h)；所述菌株DW‑1，可以以亚硝氮为唯一氮源进行新陈代谢，亚硝氮去除率达98％，亚硝氮降解速率达0.83mg/(L·h)；所述DW‑1菌株，通过SND方法实现含氮污水的生物脱氮，实验证明，采用所述菌株DW‑1在好氧条件下处理淡水养殖水体，氨氮或亚硝氮在处理24h时降解率分别为48.6％和71.8％；处理48h时，降解率分别为93.2％和91.3％。本发明提供的皱褶念珠菌菌株DW‑1可同时实现硝化‑反硝化功能，使用方便，操作简单，降低了淡水养殖成本，实现了淡水绿色养殖的目的。该菌株DW‑1可作为新型微生态制剂的良好菌株，具有良好的应用前景。

[0027] 本发明提供了本发明提供了一株异养硝化好氧反硝化的皱褶念珠菌(Diutina rugosa)菌株DW‑1，保藏编号为CCTCC NO：M2019166。所述菌株DW‑1分别采用形态学和分子生物鉴定，结果如下：

[0028] (1)形态特征

[0029] 本发明皱褶念珠菌DW‑1菌落形态：菌落呈圆形，乳白色，湿润，表面光滑，不透明。

[0030] (2)分子生物鉴定

[0031] 利用26S rDNA基因的扩增引物，以DW‑1菌株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，得到PCR产物共有504bp；所述序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST检索程序系统进行序列同源性分析，发现与皱褶念珠菌(Diutina rugosa)的26S rDNA D1/D2区基因序列相似度为100％。

[0032] 根据本发明所述DW‑1菌株的形态特征、生理生化性质和分子生物学鉴定特征，鉴定DW‑1菌株属于皱褶念珠菌，并命名为皱褶念珠菌DW‑1(Diutina rugosa DW‑1)。

[0033] 本发明提供的所述DW‑1菌株可同时实现硝化‑反硝化功能，直接将氨氮或亚硝态氮转化为气体产物，亚硝酸盐和硝酸盐氮积累量较少，以氨氮或亚硝氮为唯一氮源进行新陈代谢，处理36h后，氨氮去除率可达90.28％，亚硝氮去除率达98％。

[0034] 在本发明中，所述菌株DW‑1的培养方法，优选包括以下步骤：

[0035] 将菌株DW‑1接种于液体种子培养基中，在28～32℃,160～200r/min恒温振荡培养，得到种子液；所述液体种子培养基：20％土豆汁1000mL，葡萄糖20.0g，pH值自然；在121℃灭菌25min备用。

[0036] 基于所述菌株DW‑1可同时实现硝化‑反硝化功能，本发明提供了一种降解淡水养殖污水中氨氮和亚硝氮的微生物制剂，包括所述皱褶念珠菌(Diutina rugosa)菌株DW‑1。10 15
所述皱褶念珠菌(Diutina rugosa)菌株DW‑1的活菌浓度优选为10 ～10 CFU/mL。本发明对所述微生物制剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的微生物制剂的制备方法即可。

[0037] 本发明提供了所述皱褶念珠菌(Diutina rugosa)菌株DW‑1或所述微生物制剂在淡水水产养殖水体脱氮中的应用。

[0038] 在本发明中，所述淡水水产养殖水体脱氮的方法，优选包括以下步骤：

[0039] 在淡水养殖污水中接入皱褶念珠菌DW‑1菌株的菌液，进行好氧培养的同时进行脱氮处理。所述淡水养殖水体优选包括池塘、湖泊、河流或水库。所述淡水水产养殖水体脱氮中的氮优选包括氨氮和/或亚硝氮。在淡水水产养殖水体中，氨氮和亚硝氮组成的总氮、氨氮或亚硝氮的浓度优选为40～100mg/L，更优选为50～80mg/L。

[0040] 在本发明中，所述皱褶念珠菌DW‑1菌株的菌液的活菌浓度优选为1010～1015CFU/11 14 13
mL，更优选为10 ～10 CFU/mL，最优选为10 CFU/mL。所述皱褶念珠菌DW‑1菌株的菌液的接种量为0.1％～1％，更优选为0.3％～0.8％，最优选为0.5％。

[0041] 在本发明中，所述淡水养殖污水的初始pH值优选为4.0～8.5，更优选为6.0～8.0，最优选为7.0～7.5。在好氧培养期间，所述淡水养殖污水的溶氧量优选为1.5～3mg/L，更优选为2.0mg/L。

[0042] 在本发明中，所述好氧培养的培养温度优选为20～36℃，培养温度根据去除的氮的种类不同而有所差异，对氨氮的去除时，培养温度优选为28～36℃，最优选为32℃。对亚硝氮去除时，培养温度优选为20～28℃，最优选为20℃。所述好氧培养的时间优选为24～48h。

[0043] 在本发明中，在所述好氧培养期间，淡水养殖污水中C/N比优选为10～25。C/N比根据去除的氮的种类不同而有所差异，去除氨氮时，C/N比优选为15～25，最优选为25℃。去除亚硝氮时，C/N比优选为10～25，最优选为10。

[0044] 在本发明中，好氧培养结束后，测定水体中氨氮和/或亚硝氮的含量。采用《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》(HJ 535‑2009)测定氨氮；采用《水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法》(GB7493‑87)测定亚硝氮。

[0045] 下面结合实施例对本发明提供的一株异养硝化好氧反硝化的皱褶念珠菌菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0046] 实施例1

[0047] 菌株的筛选方法

[0048] 1.初筛

[0049] 从含氨氮量高的淡水养殖水体中采集水样10mL，加入到100mL含52.39mg/L氨氮的培养基中，30℃，180r/min条件下富集培养3d，得到富集液备用。

[0050] 2.将制备的富集液按照10倍稀释法稀释至10‑7，分别取10‑5、10‑6、10‑7三个不同稀释度的稀释液涂布于硝化固体培养基平板上，并置于30℃恒温箱中培养48h，得到菌落。

[0051] 所述硝化固体培养基(g/L)配方及制备方法如下：(NH4)2SO4·7H2O 0.247g、K2HPO47g、KH2PO43g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.05g、H2O 1L，琼脂20g。用蒸馏水定容，初始pH值为7.0，121℃灭菌20min，制成硝化固体培养基平板。

[0052] 3.纯化

[0053] 挑取上述硝化固体培养基平板上的单菌落在硝化固体培养基平板上划线，于30℃恒温箱中培养48h，直到得到单一菌落。

[0054] 4.保存

[0055] 将上述获得的单菌落分别接种于PDA固体斜面培养基上，30℃恒温箱中培养48h，4℃冰箱中保存。

[0056] 所述PDA固体斜面培养基的配方及制备方法如下：20％土豆汁1000mL，葡萄糖20.0g，琼脂粉20.0g，pH值自然。121℃灭菌25min，制成PDA固体培养基平板。

[0057] 5.复筛

[0058] 将分离的菌株接种于液体种子培养基中，30℃，180r/min恒温振荡培养24h。所述液体种子培养基配方及制备方法：20％土豆汁1000mL，葡萄糖20.0g，pH值自然。121℃灭菌25min。

[0059] 将培养好的液体种子培养基按1％的接种量分别接种于氨氧化培养基(初始氮浓度52.39mg/L)和亚硝酸盐还原培养基(初始氮浓度40.58mg/L)中，分别在30℃，180r/min恒温振荡培养，36h后测定氨氮、亚硝氮。所述氨氧化培养基配方及制备方法：(NH4)2SO4·7H2O 0.247g、K2HPO4 7g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.05g、H2O 1L。121℃灭菌
25min。所述亚硝酸盐还原培养基配方及制备方法：NaNO2 0.2g、K2HPO4 7g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.05g、H2O 1L。121℃灭菌25min。采用《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》(HJ 535‑2009)测定氨氮；采用《水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法》(GB7493‑87)测定亚硝氮。

[0060] 6.异养硝化‑好氧反硝化菌株的确定

[0061] 根据步骤5的结果，挑选出异养硝化‑好氧反硝化性能最高的菌株，该菌株可以以氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，氨氮去除率可达90.28％，氨氮降解速率达0.99mg/(L·h)。同时DW‑1菌株可以以亚硝氮为唯一氮源进行新陈代谢，亚硝氮去除率达98％，亚硝氮降解速率达到0.83mg/(L·h)。命名为DW‑1菌株。

[0062] 实施例2

[0063] 菌株DW‑1的形态特征及生理生化特征鉴定

[0064] 1.形态特征鉴定

[0065] 菌株DW‑1的菌落形态特征如下：

[0066] 将菌株DW‑1接种于液体种子培养基中，在30℃，180r/min条件下振荡培养24后，按‑8 ‑6 ‑7 ‑8照10倍稀释法稀释至10 ，取10 、10 、10 三个不同稀释度的稀释液0.1mL均匀涂布于PDA固体培养基平板表面，30℃恒温条件下培养24h，观察菌落特征如下：菌落呈圆形，乳白色，湿润，表面光滑，不透明(见图1和图2)。

[0067] 实施例3

[0068] 26S rDNA序列分析

[0069] 1.菌株DW‑1基因组的提取

[0070] (1)菌体培养：将菌株DW‑1接种于PD液体培养基中，在30℃，180r/min条件下振荡培养24后，在4℃，10000r/min条件下离心收集菌体。

[0071] (2)基因组DNA提取：使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒提取DW‑1菌株的26S rDNA D1/D2区基因组DNA。

[0072] (3)保存：将提取到的DW‑1菌株基因组DNA置于‑20℃。

[0073] (4)检测：将提取到的DW‑1菌株基因组DNA经1％琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中观测、照相，得到电泳图如图3所示。

[0074] 2.PCR扩增

[0075] PCR扩增引物使用26S  rDNA  D1/D2区的通用引物NL1(5 '‑GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG‑3'，SEQ ID No.1)和NL4(5'‑GGTCCGTGTTTCAAGACGG‑3'，SEQ ID No.2)。

[0076] PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min，得到PCR产物。

[0077] 3.26S rDNA D1/D2区的全序列测定和分析回收得到PCR产物，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，得到菌株DW‑1的26S rDNAD1/D2区基因全序列共有504个碱基(GCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAAGCCCGCGGGCGTTGTAATTTGCAGGCGGATGTTTTGGGGCGGGCGCTGTCTACGTTCCTTGGAACAGGACGCCGCAGAGGGTGAGAGCCCCGTGCGATGGCGCCTCTAACCGCGTAAAACTCCGCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCCAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATGCGATTAGCGGCCAGCAGGAGGTGCCTTCTCGTGAAAAGGCCGTGCACCGTCTTCGGACACCGTGCGCGGAGATGGCGAGGGGGCGCCTGAGGTCTGCGAACTCGAGGTTGCTGGCGTAATGATTGCATACCACCCGTCTT，SEQ ID No.3)。所述序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST检索程序系统进行序列同源性分析，构建系统发育树(见图4)，发现与皱褶念珠菌(Diutina rugosa)的26S rDNAD1/D2区的基因序列的相似度为100％。

[0078] 参照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)的内容，根据本发明所述DW‑1菌株的形态特征、生理生化性质和分子生物学鉴定特征，鉴定DW‑1菌株属于皱褶念珠菌(Diutina rugosa)，并定名为皱褶念珠菌DW‑1(Diutina rugosa DW‑1)。

[0079] 实施例4

[0080] 不同C/N比对菌株DW‑1处理淡水养殖污水脱氮的实验

[0081] 将菌株DW‑1接种于培养基：20％土豆汁1000mL，葡萄糖20.0g，pH值自然。并置于30℃，180r/min培养24h，得到菌株DW‑1种子液。

[0082] 将制备的菌株DW‑1种子液按0.1％(V/V)的接种量接种于养殖废水中(氨氮为18.24mg/L，亚硝氮为0.104mg/L)，其中养殖废水的C/N比分别为10、15、20、25、30，在30℃条件下好氧(溶解氧为2.5mg/L)培养24h后测定养殖废水中的氨氮、亚硝氮及总氮含量，统计去除率。

[0083] 结果如图5所示。图5为不同C/N比条件下，养殖废水采用菌株DW‑1处理后总氮、氨氮和亚硝氮的去除率。由图5可知，氨氮处理中，C/N比为15～25时，去除率达到80％以上，其中C/N比为25时，去除率最高达到95％，而C/N比为10或30时，氨氮去除率仅为60％左右；亚硝氮处理中，随着C/N比的增高，去除率略有下降，其中C/N比为10时，去除率达到85％以上，C/N比为15～25时，去除率达到60％以上，C/N比为30时，去除率最低，仅达到50％。

[0084] 实施例5

[0085] 不同C/N比对菌株DW‑1处理淡水养殖污水脱氮的实验

[0086] 将菌株DW‑1接种于培养基：20％土豆汁1000mL，葡萄糖20.0g，pH值自然。并置于30℃，180r/min培养24h，得到菌株DW‑1种子液。

[0087] 将制备的菌株DW‑1种子液按0.1％(V/V)的接种量接种于养殖废水中(氨氮为18.24mg/L，亚硝氮为0.104mg/L)，其中养殖废水的C/N比为10:1，培养温度分别设置为20℃、24℃、28℃、32℃和36℃，在好氧条件(溶解氧为2.3mg/L)下培养24h后测定养殖废水中的氨氮、亚硝氮及总氮含量，统计去除率。

[0088] 结果见图6。图6为不同培养温度下，养殖废水采用菌株DW‑1处理后总氮、氨氮和亚硝氮的去除率。由图6可知，温度对菌株DW‑1处理淡水养殖污水中氨氮去除效果有较大影响，具体的随着温度的升高，氨氮的去除率逐渐升高，到32℃时，去除率达到最佳(90％以上)，36℃时去除率略有下降(85％)，因此，氨氮的去除过程中，培养温度可以选择28～36℃范围，去除率达到75％以上。在同一体系中，相比于氨氮的去除效果，亚硝氮的去除效果略低，具体的培养温度对菌株DW‑1处理淡水养殖污水中氨氮去除效果影响不大，其中以20℃培养温度对亚硝氮的去除效果较高，去除率达到60％以上，随着培养温度的升高，亚硝氮的去除率略有下降，因此，亚硝氮的去除过程中，培养温度可以选择220～28℃范围，去除率达到45％以上。

[0089] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

[0019] 图1为皱褶念珠菌DW‑1在PDA固体培养基平板上的菌落照片；

[0020] 图2为皱褶念珠菌DW‑1在普通光学显微镜下的细胞形态；

[0021] 图3为皱褶念珠菌DW‑1的26S rDNA基因扩增片段的电泳图；

[0022] 图4为皱褶念珠菌DW‑1的26S rDNA基因构建的系统发育进化树；

[0023] 图5为不同C/N比条件下，养殖废水采用菌株DW‑1处理后总氮、氨氮和亚硝氮的去除率结果图；

[0024] 图6为不同培养温度下，养殖废水采用菌株DW‑1处理后总氮、氨氮和亚硝氮的去除率。

[0025] 生物材料保藏信息

[0026] 皱褶念珠菌DW‑1(Diutina rugosa DW‑1)，于2019年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(单位简称CCTCC)，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2019166。