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采用免疫磁纳米粒子和SPR技术相结合检测溴氰菊酯的方法 0 0

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申请进展

基本信息

申请人信息

代理人信息

摘要

法律状态

权利要求

说明书

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2013-09-30

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2014-01-22

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

2014-06-11

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2033-09-30

基本信息

有效性	有效专利	专利类型	发明专利
申请号	CN201310460621.3	申请日	2013-09-30
公开/公告号	CN103472219B	公开/公告日	2014-06-11
授权日	2014-06-11	预估到期日	2033-09-30
申请年	2013年	公开/公告年	2014年
缴费截止日
分类号	G01N33/53 、G01N21/552	主分类号	G01N33/53
是否联合申请	独立申请	文献类型号	B
独权数量	1	从权数量	3
权利要求数量	4	非专利引证数量	9
引用专利数量	5	被引证专利数量	0
非专利引证	1、Ru-Ping Liang等.Magnetic Fe3O4 composite-enhanced surface plasmon resonance for ultrasensitive detection of magnetic nanoparticle-enriched α-fetoprotein..《Analytica Chimica Acta》.2012,第737卷; 2、Lucian-Gabriel Zamfir等.Highly sensitive label-free immunosensor for ochratoxin A based on functionalized magnetic nanoparticles and EIS/SPR detection..《Sensors and Actuators B: Chemical》.2011,第159卷; 3、Scott D. Soelberg等.Surface plasmon resonance detection using antibody-linked magnetic nanoparticles for analyte capture, purification, concentration, and signal amplification..《Anal Chem》.2009,第81卷; 4、Lucian-Gabriel Zamfir等.Highly sensitive label-free immunosensor for ochratoxin A based on functionalized magnetic nanoparticles and EIS/SPR detection..《Sensors and Actuators B: Chemical》.2011,第159卷; 5、Scott D.Soelberg等.Surface plasmon resonance detection using antibody-linked magnetic nanoparticles for analyte capture, purification, concentration, and signal amplification..《Anal Chem》.2009,第81卷; 6、Gemma Aragay.Nanomaterials for sensing and destroying pesticides..《Chem Rev》.2012,第112卷; 7、Jung-Soon Park等.A surface plasmon resonance biosensor for detecting Pseudomonas aeruginosa cells with self-assembled chitosan-alginate multilayers..《Talanta》.2007,第72卷; 8、S.T.Koev等.Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-chip devices..《Lab Chip》.2012,第10卷; 9、Ru-Ping Liang等.Magnetic Fe3O4@Au composite-enhanced surface plasmon resonance for ultrasensitive detection of magnetic nanoparticle-enriched α-fetoprotein..《Analytica Chimica Acta》.2012,第737卷;
引用专利	CN102519912A、CN102628803A、CN102947703A、CN101629909A、CN102072894A	被引证专利
专利权维持	4	专利申请国编码	CN
专利事件		事务标签	公开、实质审查、授权

申请人信息

申请人	湖南农业大学	第一申请人	湖南农业大学
专利权人	湖南农业大学	当前专利权人	湖南农业大学
发明人	刘霞、李文进、李蕾、毛璐刚、杨阳	第一发明人	刘霞
地址	湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南农业大学	邮编
申请人数量	1	发明人数量	5
申请人所在省	湖南省	申请人所在市	湖南省长沙市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

长沙正奇专利事务所有限责任公司

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

何为、袁颖华

摘要

一种采用免疫磁纳米粒子和SPR技术相结合检测溴氰菊酯的方法，该方法是将免疫磁纳米粒子加入到含溴氰菊酯的待测样品溶液中，使免疫磁纳米粒子与溴氰菊酯发生特异性结合，经外加磁场分离后得到结合物，将该结合物直接注入经壳聚糖修饰的SPR芯片表面，以检测出待测样品溶液中的溴氰菊酯含量。上述免疫磁纳米粒子是将磁纳米粒子表面的羧基用EDC/NHS混合液活化后，加入溴氰菊酯的单克隆抗体溶液，再加入乙醇胺封闭，经外加磁场分离后，用PBS缓冲液定容制得。本方法将样品前处理和检测技术相结合，有效提高了检测的灵敏度和准确性，且操作简单，快速、选择性高、重现性和再生性好，回收率符合要求，可直接对农产品中溴氰菊酯的残留进行检测，具有重要的实际应用价值。

摘要附图
说明书附图：图1
说明书附图：图2
说明书附图：图3
说明书附图：图4
说明书附图：图5

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2014-06-11	授权
2	2014-01-22	实质审查的生效	IPC(主分类): G01N 33/53 专利申请号: 201310460621.3 申请日: 2013.09.30
3	2013-12-25	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1.一种采用免疫磁纳米粒子和SPR技术相结合检测溴氰菊酯的方法，其特征在于，该方法是将免疫磁纳米粒子加入到含溴氰菊酯的待测样品溶液中，使免疫磁纳米粒子与溴氰菊酯发生特异性结合，经外加磁场分离后得到免疫磁纳米粒子和溴氰菊酯的结合物，将该结合物直接注入经壳聚糖修饰的SPR芯片表面，获得SPR响应信号，以检测出待测样品溶液中的溴氰菊酯含量；
其中，上述免疫磁纳米粒子是取200μL1.9-3.8mM的羧基化磁纳米粒子溶液，加入
0.4M的EDC和0.1M的NHS混合溶液共400μL，漩涡震荡5-10min，冰浴超声5-10min后，再加入200μL0.27-0.55mg/mL溴氰菊酯单克隆抗体溶液，漩涡震荡5-10min，冰浴超声
5-10min，加入0.1M乙醇胺200μL，漩涡震荡5-10min，静置15-20min，经外加磁场分离后，用PBS缓冲液清洗并定容至200μL，得到。

2.如权利要求1所述的采用免疫磁纳米粒子和SPR技术相结合检测溴氰菊酯的方法，其特征在于，所述溴氰菊酯单克隆抗体溶液是取3.3mg溴氰菊酯单克隆抗体加入PBS缓冲液1ml配制成3.3mg/mL的母液，再用PBS缓冲液稀释而成。

3.如权利要求1所述的采用免疫磁纳米粒子和SPR技术相结合检测溴氰菊酯的方法，其特征在于，所述经壳聚糖修饰的SPR芯片是将SPR芯片在无水乙醇中浸泡3-8min，经纯水冲洗，氮气吹干后，用氢火焰灼烧15-30s，冷却后装入SPR仪器，待基线走平后，以
10-20μL/min的流速通入50-100μL0.4mg/mL的巯基乙胺溶液，再以10-20μL/min的流速通入50-100μL1.2-1.8mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，使该壳聚糖醋酸溶液在SPR芯片表面进行自组装制得。

4.如权利要求3所述的采用免疫磁纳米粒子和SPR技术相结合检测溴氰菊酯的方法，其特征在于，所述壳聚糖醋酸溶液是取200mg壳聚糖溶于pH值为3.6的50mL50mM醋酸-醋酸钠缓冲液中，60℃磁力搅拌2-4h，冷却后，再用pH值为3.6的50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释而成。

说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及农药分析及生物传感器技术领域，具体的是涉及一种利用免疫磁纳米粒子检测农产品中残留的溴氰菊酯的SPR免疫传感器方法。

背景技术

[0002] 溴氰菊酯，是目前菊酯类杀虫剂中毒力最高的一种。溴氰菊酯属于中毒毒类，皮肤接触可引起刺激症状，出现红色丘疹。急性中毒时，轻者有头痛、头晕、恶心、呕吐、食欲不振、乏力，重者还可出现肌束颤抖和抽搐。目前溴氰菊酯残留的检测方法主要有气相色谱、高效液相色谱、色谱/质谱联用技术、酶联免疫分析等。其中色谱分析法仪器设备贵重，样品前处理复杂，需专业人员；而酶联免疫分析方法相对复杂，灵敏度较低，耗时，成本较高，且均需要复杂的样品前处理。与上述检测方法相比，表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）传感技术是一种基于物质折射率变化的、可实时动态监测的现代检测技术，具有快速、高灵敏、耗样量少、无需标记、芯片可重复使用等特性，且操作简单，但无法直接高灵敏地检测溴氰菊酯农药小分子。

[0003] 农药残留分析是复杂混合物中痕量组分的分析技术，采用适当的农药残留提纯方法是成功建立准确、快速、高灵敏农药残留检测技术的关键。近年来发展的磁性纳米材料是一种新型的亲和性固相载体，在外加磁场下具有可控运动的特点，所需设备简单，操作柔和。将磁纳米粒子与各种分析方法相结合应用于检测，可以在复杂的体系中快速富集待检物，得到浓缩、纯净的样品，有助于缩短检测时间及检测的准确度。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有SPR传感器无法实现直接高灵敏检测溴氰菊酯农药小分子，以及农产品样品前处理复杂的问题，提供一种采用免疫磁纳米粒子和SPR技术相结合检测溴氰菊酯的方法。该方法不仅将样品前处理和检测技术相结合，提高了方法的灵敏度和准确性，且操作简单，检测快速、选择性高、重现性和再生性好，回收率符合要求，可直接对农产品中溴氰菊酯残留进行检测，具有重要的实际应用价值。

[0005] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种采用免疫磁纳米粒子和SPR技术相结合检测溴氰菊酯的方法，该方法是将免疫磁纳米粒子加入到含溴氰菊酯的待测样品溶液中，使免疫磁纳米粒子与溴氰菊酯发生特异性结合，经外加磁场分离后得到结合物，将该结合物直接注入经壳聚糖修饰的SPR芯片表面，以检测出待测样品溶液中的溴氰菊酯含量。

[0006] 上述检测溴氰菊酯的过程详述如下，请结合参见图1：

[0007] 1、磁纳米粒子的制备和表征：取0.5g富里酸加入60mL纯水并置于圆底烧瓶中，通入氮气除氧的同时并用恒温磁力搅拌器200r/min搅拌加热至沸腾，沸腾后立即加入5mL含有0.6g NaOH、1.08g FeCl3·6H2O和0.6g FeSO4·7H2O的混合溶液，回流2h。待溶液冷却至室温后，经磁性分离，多次纯水洗涤至中性，分别采用紫外光谱、傅里叶红外光谱和透射电子显微镜表征，结合参见图2。

[0008] 上述羧基化磁纳米粒子的制备方法为现有技术，可参考已报道的表面羧基化磁纳米粒子的合成方法[Chunjiao Zhou et al,Fulvic acid coated iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging contrast agent,Funct.Mater.Lett.03(2010)197-200页]。

[0009] 2、免疫磁纳米粒子的制备：取200μL1.9-3.8mM的羧基化磁纳米粒子溶液，加入400μL的EDC/NHS（0.4M/0.1M）混和液，漩涡震荡5-10min，冰浴超声5-10min后，加入
200μL0.27-0.55mg/mL溴氰菊酯单克隆抗体溶液，漩涡震荡5-10min，冰浴超声5-10min后，加入0.1M乙醇胺200μL，漩涡震荡5-10min，静置15-20min后，经外加磁场分离后，用PBS缓冲液(10mM、pH7.4)清洗并定容至200μL，置于4℃冰箱中保存备用，分别采用紫外光谱、傅里叶红外光谱和透射电子显微镜进行表征，结合参见图2。

[0010] 上述0.27-0.55mg/mL的溴氰菊酯单克隆抗体溶液是取3.3mg溴氰菊酯单克隆抗体（购买于武汉三鹰生物技术有限公司）加入1ml PBS缓冲液(10mM、pH7.4)配制成3.3mg/mL的母液，再用PBS缓冲液(10mM、pH7.4)稀释而成。

[0011] 3、SPR传感器的构建：将SPR芯片在无水乙醇中浸泡3-8min，经纯水冲洗，氮气吹干后，用氢火焰灼烧15-30s，冷却后装入SPR仪器，待基线走平后，以10-20μL/min的流速通入50-100μL0.4mg/mL的巯基乙胺溶液，再以10-20μL/min的流速通入50-100μL1.2-1.8mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，使该壳聚糖醋酸溶液在SPR芯片表面进行自组装（利用巯基乙胺的氨基与壳聚糖表面的羧基反应，使壳聚糖固定在芯片表面）制得。

[0012] 上述1.2-1.8mg/mL的壳聚糖醋酸溶液是取200mg壳聚糖溶于50mL50mM醋酸-醋酸钠缓冲液（pH3.6）中，60℃磁力搅拌2-4h，冷却后，再用50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH3.6）稀释而成。

[0013] 4、免疫磁纳米粒子高效富集待测物溴氰菊酯：取上述制备的免疫磁纳米粒子加入含有溴氰菊酯的样品溶液，漩涡震荡5-10min后，冰浴超声5-10min，然后静置15-20min，经外加磁场分离后得到结合物，该结合物用PBS缓冲液(10mM、pH7.4)反复洗涤3次，用PBS定容后备用。

[0014] 5、将上述得到的免疫磁纳米粒子和溴氰菊酯的结合物直接注入传感器进行检测，即可得到样品溶液中溴氰菊酯的的含量。

[0015] 本发明利用免疫磁纳米粒子与溴氰菊酯会发生特异性结合，经外加磁场分离后得到的结合物直接注入经壳聚糖修饰的SPR芯片表面，壳聚糖表面的氨基与溴氰菊酯的溴原子可发生霍夫曼烷基化反应，使芯片表面的折射率随着结合物中溴氰菊酯浓度的变化而变化，从而引起SPR响应信号的变化，据此可对溴氰菊酯直接进行定量分析，最低检测限为2.5pg/mL。

[0016] 本发明与传统的检测方法及同类传感器比较，其2.5pg/mL的检测限比大多数文献报道的更低，见表1。

[0017] 表1本发明与传统检测方法及同类传感器的对比

[0018]

[0019] 与现有技术相比，本发明的优点如下：

[0020] 1、本发明利用磁纳米粒子的比表面积使之固定的抗体量增加，且免疫磁纳米粒子本身具有大的折射率，有效地提高了SPR的响应信号，使得新构建的SPR传感器具有很高的灵敏度，最低检测限为2.5pg/mL。

[0021] 2、本发明利用免疫磁纳米粒子与溴氰菊酯发生特异性结合，经外加磁场分离后得到的结合物直接进行SPR检测，将样品前处理技术与检测技术相结合，有效提高了检测的准确性，且操作简单，检测速度快。此外该SPR传感器具有良好的特异性、重现性和回收率，可直接对农产品中溴氰菊酯残留进行检测，具有重要的实际应用价值。

附图说明

[0022] 图1为本发明的溴氰菊酯传感器构建示意图。

[0023] 其中，a表示磁纳米粒子，b表示乙醇胺，c表示溴氰菊酯的单克隆抗体，d表示溴氰菊酯，e表示壳聚糖，f表示巯基乙胺，g表示金膜，h表示玻片，i表示棱镜。

[0024] 图2为本发明中磁纳米粒子、免疫磁纳米粒子及其特异性结合溴氰菊酯复合物的紫外表征图。

[0025] 其中：a表示磁纳米粒子+溴氰菊酯的单克隆抗体+溴氰菊酯+壳聚糖，b表示磁纳米粒子+溴氰菊酯的单克隆抗体，c表示溴氰菊酯+溴氰菊酯的单克隆抗体，d表示磁纳米粒子，e表示溴氰菊酯，f表示溴氰菊酯的单克隆抗体，g表示壳聚糖+巯基乙胺。

[0026] 图3为本发明的SPR传感器的特异性。

[0027] 其中，a表示溴氰菊酯、阿特拉津及氰戊菊酯的混合液，b表示溴氰菊酯和氰戊菊酯的混合液，c表示溴氰菊酯和阿特拉津的混合液，d表示溴氰菊酯，e表示阿特拉津，f表示氰戊菊酯。

[0028] 图4为本发明检测溴氰菊酯的SPR动力学曲线。

[0029] 其中，各曲线代表的溴氰菊酯浓度分别为：a--25ng/mL、b--10ng/mL、c--5ng/mL、d--1ng/mL、e—750pg/mL、f--500pg/mL、g--250pg/mL、h--100pg/mL、i--50pg/mL、j--25pg/mL、k--10pg/mL。

[0030] 图5为本发明检测溴氰菊酯的标准曲线。具体实施方式：

[0031] 实施例1、本发明构建的SPR传感器的特异性实验

[0032] 将本发明构建的SPR免疫传感器分别对1ng/mL的溴氰菊酯、1ng/mL的氰戊菊酯、1ng/mL的阿特拉津，1ng/mL的溴氰菊酯和1ng/mL的氰戊菊酯和1ng/mL的阿特拉津的混合物，1ng/mL的溴氰菊酯和1ng/mL的氰戊菊酯的混合物，以及1ng/mL的溴氰菊酯和1ng/mL的阿特拉津的混合物进行检测，比较相应的SPR响应信号的变化，考察该传感器的特异性。
结果表明，结合参见图3，本发明构建的SPR传感器具有很好的特异性。

[0033] 实施例2、检测溴氰菊酯标准曲线的建立

[0034] 将构建好的SPR传感器（壳聚糖醋酸溶液的浓度为1.5mg/mL）在流速为10μL/min的条件下，对免疫磁纳米特异性结合的不同浓度溴氰菊酯的结合物(0,0.010,0.025,0.050,0.075,0.1,0.5,0.25ng/mL,n=3)进行检测，建立检测溴氰菊酯的标准曲线，线性范围：
0.01-1ng/mL，最低检测限为2.5pg/mL，结合参见图4和图5。

[0035] 实施例3、加标回收率实验

[0036] 取适量溴氰菊酯标样添加到大豆样品中，设置0.75、0.5、0.25ng/mL三个浓度，每个浓度重复检测三次，考察该构建的SPR传感器的准确性。

[0037] 大豆样品的前处理：大豆经烘干后粉碎并过100目筛，称1g大豆粉加入至6mL80％甲醇溶液中，震荡10min后，以10000rpm离心3min。取上清液，并用80％甲醇定容成0.1g／mIJ溶液，再经0.2p m膜过膜处理后，稀释成1mg／mL溶液4℃保存，如大豆样品为液体，则直接加入溴氰菊酯标样。

[0038] 检测结果见表2，大豆回收率为96.94—103.60％，变异系数2.18—13.72％，回收率在允许范围(低浓度回收率允许范围为70—130％)内，符合回收率的要求。

[0039] 表2回收率实验

[0040]

1一种可将样品快速固化成型的钢桥沥青路面剪切疲劳度检测装置 2一种测量水汽变温吸收光谱的系统及其使用方法 3地磅无人值守装置 4一种长管道的热除污机器人及其除污方法 5高精度智能酸度计及其测量方法 6一种高强度结构陶瓷加工用耐磨性能检测设备 7一种环保检测专用的污水水质检验仪 8一种便携式地质勘探用浅层取样钻机 9一种透明瓶装液体的杂质识别装置 10一种木头用除虫罐检测装置