一种路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的用途   0    0

[0001] 本发明涉及一种鲨鱼软骨活性成分的用途，尤其涉及一种路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的用途。

[0002] 血管生成是肿瘤、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎和慢性炎症等血管增生性疾病的重要病理特征之一。而以抗血管生成为主的肿瘤生物治疗研究成为近十多年来抗肿瘤药物的研究热点。

[0003] 与以直接杀伤肿瘤细胞为目的的化学治疗相比，肿瘤血管生成抑制剂（Tumor angiogenesis inhibitor，TAI）具有以下独特优点：（1）TAI直接作用于血管内皮细胞，而抗癌药物经组织扩散时受到组织纤维化、坏死等的影响，经常在组织内达不到有效药物浓度；（2）相对于基因型不稳定肿瘤细胞，血管内皮细胞属正常细胞，基因型稳定，不易产生耐药性；（3）原发肿瘤和继发肿瘤的血管内皮细胞相同，而原发灶与继发灶中肿瘤细胞的生物学特性差异较大，化疗反应亦不同；（4）肿瘤血管内皮细胞的增殖速度比正常组织快许多倍，TAI对正常组织的影响轻微。基于以上原因，抗血管生成的肿瘤治疗策略将在今后肿瘤治疗中发挥重要的作用。

[0004] 申请人研究发现，以路氏双髻鲨软骨为原料，制备血管生成抑制因子的研究处于空白阶段，而路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子在制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物中的应用更是未见报道。

[0005] 本发明的目的在于提供一种路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的药理性质，以利用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的保健食品或功能性添加剂的用途。

[0006] 本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的保健食品或功能性添加剂的用途。该因子的氨基酸序列为Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys（PDYKFK），其对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成具有显著抑制作用，Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys（PDYKFK）具有安全无毒副作用和活性强等优点。

[0007] 本发明的血管生成抑制因子可以通过如下方式制备：

[0008] 1）路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨软骨按固液比1 g：8～10 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 ℃、振荡抽提32～36 h后，于4 ℃、10 000 r/min离心15～20 min，取上清液装入截留分子量为1 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl（pH 
7.6）缓冲液于4℃以下透析22～24 h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液置于4 ℃，缓慢加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置0.5～1 h后，于4 ℃以下10 000 r/min离心15～25 min，取上清液加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度达
60%，静置0.5～1 h后，4 ℃以下、10 000 r/min离心15～25 min，取沉淀置于截留分子量为
1 kDa 的透析袋内用双蒸水于4 ℃以下透析22～24 h，透析液冷冻干燥，得路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分；

[0009] 2）路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液比1 g : 20～25 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05 mol/L，pH 9～10），得混合液；将混合液温度升至45～55 ℃预热5～10 min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1.5～2.5%加入碱性蛋白酶（酶活力≥2.0×105 U/g），酶解温度为45～55 ℃，酶解5～6 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15 min后，10 000g离心20～25 min，取上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物；

[0010] 3）路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子。

[0011] 作为优选，所述步骤1）中的路氏双髻鲨为路氏双髻鲨（Sphyrna lewini）。

[0012] 作为改进，所述步骤3）中的凝胶过滤层析、细胞膜色谱和RP-HPLC纯化的具体过程为：

[0013] 凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液配成15～25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析（2.6 × 80 cm）分离，用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最高组分为凝胶层析酶解物。

[0014] 细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用三蒸水配成40～50 μg/mL的溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最高组分为细胞膜色谱纯化酶解物。

[0015] RP-HPLC纯化：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用三蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用得1个高活性多肽Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys（PDYKFK），ESI-MS检测分子量为796.90 Da。

[0016] 优选，所述细胞膜色谱条件为：进样量5～10 μL；细胞膜色谱柱（150 mm × 4.6mm，5 μm）；柱温为37 ℃；流动相：三蒸水；紫外检测波长215 nm；流速：0.2 mL/min。

[0017] 优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15～20 μL；色谱柱为Zorbax C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为20 %乙腈；紫外检测波长为215 nm。

[0018] 再优选，所述细胞膜色谱柱中采用的细胞膜为人脐静脉血管内皮细胞株ECV304的细胞膜。

[0022] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0023] 实施例：一种路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法，制备流程如下：路氏双髻鲨软骨→组织破碎→盐酸胍抽提→丙酮分级沉淀→凝胶过滤层析纯化→细胞膜色谱纯化→高效液相色谱纯化→血管生成抑制因子。

[0024] 1）路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨（Sphyrna lewini）软骨按固液比1 g：10 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 ℃、振荡抽提36 h后，于4 ℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液装入截留分子量为1 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl（pH 7.6）缓冲液于4℃以下透析24 h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液置于4 ℃，缓慢加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置1 h后，于4 ℃以下10 000 r/min离心25 min，取上清液加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置1 h后，4 ℃以下、10 000 r/min离心25 min，取沉淀置于截留分子量为1 kDa 的透析袋内用双蒸水于4 ℃以下透析24 h，透析液冷冻干燥，得路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分；

[0025] 2）路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液比1 g : 25 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05 mol/L，pH 9～10），得混合液；将混合液温度升至45～55 ℃预热5 min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1.8%加入碱性蛋白酶（酶活力≥2.0×105 U/g），酶解温度为50 ℃，酶解5 h后，将溶液升温至95℃，并于此温度保持12 min后，10 000g离心25 min，取上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物；

[0026] 3）路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子。

[0027] ①凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 7.0磷酸盐缓冲液配成25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析（2.6 × 80 cm）分离，用pH 7.0磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最强组分为凝胶层析酶解物Fr.C（图1）。

[0028] ②细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物Fr.C用三蒸水配成50 μg/mL的溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化（条件：进样量50 μL；人脐静脉血管内皮细胞株ECV304的细胞膜柱（150 mm × 4.6mm，5 μm）；柱温为37 ℃；流动相：三蒸水；紫外检测波长215 nm；流速：0.2 mL/min），其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最强组分为细胞膜色谱纯化酶解物Fr.C-II（图2）。

[0029] ③RP-HPLC纯化：将上述细胞膜色谱纯化酶解物Fr.C-II用三蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（条件：进样量15 μL；色谱柱为Zorbax C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为20 %乙腈；紫外检测波长为215 nm），根据对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用得1个高活性多肽。

[0030] ④结构检测：收集对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最强的多肽，经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys（PDYKFK），ESI-MS检测分子量为796.90 Da。

[0031] 将制得的Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys（PDYKFK）进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制活性测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等“改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术－无气室孵育法”（记载于《中山大学学报（自然科学版）》，2003年第2册（第42卷）： 第126-128页）。结果表明，路氏双髻鲨血管生成抑制因子PDYKFK显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成并呈剂量依赖关系（表1）。

[0032] 表1 路氏双髻鲨血管生成抑制因子对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的抑制作用[0033]

[0034] 将制得的PDYKFK进行促血管生成因子表达影响的测定，测定方法参考孙晓佳、张月英、贾青等“蝎毒多肽提取物联合化疗抑制Lewis肺癌血管生成实验研究”（记载于《中国中药杂志》，2011年第12期（第36卷）：第1644-1649页）。给荷Lewis 肺癌小鼠腹腔注射路氏双髻鲨血管生成抑制因子PDYKFK (20.0mg/kg·d×14)，取肺癌组织进行免疫组化检查，检测结果表明：路氏双髻鲨血管生成抑制因子PDYKFK对血管内皮细胞生长因子(VEGF) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 和血小板衍生生长因子(PDGF) 等三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用(表2) 。

[0035] 表2 路氏双髻鲨血管生成抑制因子对促血管生成因子表达的抑制作用

[0036]

[0037] 尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。

[0019] 图1是本发明的超滤酶解液（≤1 kDa组分）的葡聚糖凝胶G-15柱层析色谱图；

[0020] 图2 是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备酶解物（Fr.C）的细胞膜色谱图；

[0021] 图3是本发明的细胞膜色谱纯化酶解物（Fr.C-II）的RP-HPLC色谱图。